当前位置: 首页 > >

04高山被孢霉的红四氮唑染色程度与菌体油脂中花生四烯酸含量的关系

发布时间:

第/卷 第#期 1,,# 年 +1 月 第#期

生命科学研究 89:; <=9;>=; ?;@;AB=C

456’ / 75’ # D;=’ 1,,# !!"

高山被孢霉的红四氮唑染色程度与菌体油脂中 花生四烯酸含量的关系
朱 敏 +& 余龙江 +& 肖 靓 +& 马德松 1

0 +’ 华中科技大学 生命科学与技术学院, 中国湖北 武汉 #!,,-# ; 中国湖北 武汉 #!,,3E 2 1’ 武汉经济开发区第一中学,



要:研究了高山被孢霉菌体被红四氮唑 ( $$%)染色的条件 & 并探讨了染色程度与菌体油脂中花生四烯酸

含量的关系 ’ 高山被孢霉的种子菌体被 $$% 染色的程度随种龄增加而增加, 而种子中的油脂含量和油脂中的 花生四烯酸含量也都随种龄增加而增加 ’ 在发酵过程中, 菌体被 $$% 染色的程度和菌体中的油脂含量以及油 脂中的花生四烯酸含量随培养时间增加而增加 ’ 三株具有相似油脂含量、不同花生四烯酸含量的高山被孢霉 以及一株不产花生四烯酸的鲁氏毛霉的染色结果显示菌体被红四氮唑染色的程度与菌体油脂中的花生四烯 酸含量具有正相关性 ’ 该发现有助于花生四烯酸高产菌的快速筛选 ’ 关键词: 花生四烯酸; 真菌油脂; 高山被孢霉; 红四氮唑 中图分类号: ("! 文献标识码: ) 文章编号 * +,,-.-/#- 0 1,,# 2 ,#.,!!".,3

!"##$%&’(") *$’+$$) ,’&()()- .$-#$$ "/ 012$%(& "/ !"#$%&#&’’( )’*%+( 31 4#(56$)1%’$’#&7"%(89 !6%"#(:$ &): ;#&26(:")(2 ;2(: !")’$)’ () ’6$ <8)-&% =(5(:>
QRS T9>+, US 85>L.M9A>L+, VW)X Y9>L+, T) D;.@5>L1
0 +’ !"#$%&’( )’*+,-.*/0 &1 23*,’3, #’4 5,3%’&6&(07 23%&&6 &1 8*1, 23*,’3, #’4 5,3%’&6&(07 9"%#’ #!,,-#& !":,*7 ;%*’#< 1’ =*-./ >*446, 23%&&6 &1 9"%#’ ?3&’&@0 A,+,6&B@,’/ C&’,7 9"%#’ #!,,3E& !":,*7 ;%*’# 2

;3>’#&2’: %5BB;6AO95> Z;O[;;> OC; @OA9>9>L P;LB;; 5: OC; IJ=;69A 5: >&-/*,-,66# #6B*’# ZJ OB9\C;>J6O;OBA]569KI =C65B9P; A>P ABA=C9P5>9= A=9P 9> OC; :K>LA6 69\9P@ [A@ 9>^;@O9LAO;P’ $C; @OA9>9>L P;LB;; 5: 9>5=K6KI IJ=;69A @OA9>;P ZJ OB9\C;>J6O;OBA]569KI =C65B9P; 9>=B;A@;P [9OC OC; 9>5=K6KI AL;& [C9=C \5@9O9^;6J =5BB;6AO;P O5 OC; 69\9P@ =5>O;>O 9> :K>LA6 Z95IA@@ A>P ABA=C9P5>9= A=9P =5>O;>O 9> OC; :K>LA6 69\9P@’ DKB9>L :;BI;>OAO95>& OC; @OA9>9>L P;LB;; 5: IJ=;69A @OA9>;P ZJ OB9\C;>J6O;OBA]569KI =C65B9P; [A@ :5K>P 9>=B;A@;P& [C9=C A6@5 \5@9O9^;6J =5BB;6AO;P O5 OC; 69\9P@ =5>O;>O 9> :K>LA6 Z95IA@@ A>P ABA=C9P5>9= A=9P =5>O;>O 9> OC; IJ=;69A 69\9P@’ TJ=;69A 5: OCB;; @OBA9>@ 5: >&-/*,-,66# #6B*’#& [C9=C CA^; @9I96AB 69\9P@ =5>O;>O 9> IJ=;69A A>P P9::;B;>O ABA=C9P5>9= A=9P =5>O;>O 9> 69\9P@& A>P A @OBA9> 5: >"3&- -&"D*#’". )_"!1,+& [C9=C P9P>‘O \B5PK=; ABA=C9P5>9= A=9P& [;B; @OA9>;P ZJ OB9\C;>J6O;OBA]569KI =C65B9P;’ $C; B;@K6O@ @C5[;P OCAO @OA9>9>L P;LB;; 5: IJ=;69A [A@ >5O B;6AO;P O5 OC; 69\9P =5>O;>O 9> IJ=;69A ZKO \5@9O9^;6J =5BB;6AO;P [9OC ABA=C9P5>9= A=9P =5>O;>O 9> IJ=;69A 69\9P’ $C;@;

收稿日期: 修回日期: 1,,#.,E.+, ; 1,,#.,".+, 作者简介: 朱敏 ( , 女, 湖北荆州人, 讲师, 博士, 从事微生物学研究; 余龙江 ( , 男, 湖北黄冈人, 华中科技大学教授, +"E" F ) +"EE F ) 博士, 从事生物技术研究, $;6: G /E.,1-./-3#!E!! , H.IA96* JK65>LM9A>LN IA96’ CK@O’ ;PK’ =>’

!"#













$##" 年

?),*),N[ @%= \< ][<?]> ), :(< ?%[: [’&<<,),N +? ()N( %&%’()*+,)’ %’)* ;&+*]’),N [:&%),[5 ()* +,-./^ %&%’()*+,)’ %’)*_ ?],N%> >);)*[_ !"#$%&#&’’( (’)%*(_ :&);(<,=>:<:&%A+>)]@ ’(>+&)*< 6 889 7 6 +%,& -.%&*.& /&0&(#.1U $##"U / 6 " 7 ^ !!H Y !"! 7

花生四烯酸 ( 简称 --, %&%’()*+,)’ %’)*, ., /, 00, 0"1 全顺 1 二十碳四烯酸)是 !12 系列的一种 多不饱和脂肪酸, 作为合成人体前列腺素、 凝血 烷以及白三烯的前体物质,具有广泛的生物活性
304

每 ! 个月转接一次 5 IJ- 斜面保存, !" # 液体培养方法 种子的制备及培养:保藏茄子瓶斜面用无菌 水加玻珠剧烈摇动, 洗脱, 接入内装 $## @F 种子 培养基的 .## @F 三角瓶 5 种子培养基为 .K 葡 萄糖, .#K 豆芽汁 5 种子瓶于 0.# & L @),, $. M 培 养 ! *5 摇瓶培养: $.# @F 三角瓶装 .# @F 发酵培养 基, 发酵培养基组成为: 葡萄糖 /# N L F, 豆饼汁蛋 白 . N L F,硝酸钾 ! N L F,O$ PIQ" ?!P$Q ! N L F, CNEQ" ?BP$ Q #5 . N L F,;P 25 .5 按 0#K 的接种量 接入种子, 0.# & L @),, $. M 培养 B *5 !" $ %%& 染色及染色程度的定量 新鲜菌体收获后用蒸馏水洗涤两遍,取 #5 0 N 菌体置于有盖试管,加入 889 溶液, $. M 置于暗 处放置 0 (5 菌体用蒸馏水洗涤两遍后碾磨成匀 合并抽提液, 浆, 用 $ @F 乙酸乙酯室温抽提 ! 遍, 在 "/. ,@ 波长下用 D<’R@%, JS1B.## 型分光光 度计比色确定染色程度 5 !" ’ 分析方法 菌体干重的确定: 对发酵液进行抽滤, 菌丝用 蒸馏水洗 ! 次, 测定干重 5 /# M 烘干, 油脂抽提: 0 N 菌体用 ! @F 石油醚 ( !#12# 沸 ) 程 抽提 $ 次, 蒸干溶剂, 测定菌体中油脂含量 5 油脂含量 T 油脂重量 L 菌体干重 5 油 脂 中 -- 含 量 的 确 定 : 油 脂 采 用 OQP19P! QP 进行甲酯化 U 用浙江福立分析仪器 厂 HBH# 气相色谱仪分析脂肪酸甲酯,配备交联 VV-I !# @ W #5 $. @@ 石英毛细管柱以及 VXJ 检 测器 5 炉温升温程序为 02# Y $## M , / M L @),, $## Y 保留 0# @),5 进样器温度, 检测 $$# M , $ M L @),, 器温度为 $"# M 5 利用 EXZC- 花生四烯酸甲酯 样品 标准品确定 -- 含量 5 油脂中 -- 含量 T ( -- 峰面积 L 标准品 -- 峰面积 ) W 标准品 -- 浓 度W( 样品体积 L 样品重量)

, 而且 -- 还具有重要的营养作用, 它是人类的
3$4

必需脂肪酸之一, 作为人母乳的天然成分, -- 对 于婴儿的神经及其生理的发育必不可少 ,目前 -- 已经被世界卫生组织等国际权威机构推荐作 为营养补充剂添加到婴儿配方奶粉中 5 花生四烯酸的天然来源主要是蛋黄和一些动 物脏器如猪肝, 但含量很低, 而且所含的其它成分 如磷和固醇类限制了它的使用,采用微生物发酵 法生产花生四烯酸是一种替代性来源,受到高度 关注 5 高山被孢霉 6 !"#$%&#&’’( (’)%*( 7 是一种丝 状真菌,它在以碳水化合物为碳源的培养基中生 长时, 菌体内会积累较多的油脂, 其油脂的脂肪酸 组成中含有丰富的多不饱和脂肪酸,尤其是 -含量较高, 被认为是生产 -- 的最佳菌种 5 产花生 四烯酸的菌种的筛选 、 发酵条件的优化 、 花生
3!4 3"4

四烯酸生物合成途径中关键的脱饱和酶的克隆 3 . 4 等方面都得到了广泛的研究 5 是一种 红四氮唑即氯化三苯基四氮唑 ( 889) 氧化剂,从脱氢酶接受电子后自身从无色被还原 为红色的三苯基甲 ( ,从而可 :&);(<,=>?+&@%A%,) 以表征细胞内脱氢酶的活性 5 889 染色的方法广 泛用于植物组织和细胞的活力评价 3 2 4 以及细菌呼 吸活力的测定 5 但尚未有报道 889 对丝状真菌 尤其是 -- 产生菌高山被孢霉的染色 5 本实验目
3B4

的是探讨红四氮唑对花生四烯酸产生菌高山被孢 霉的染色条件及菌体染色程度与菌体油脂中花生 四烯酸含量的关系,以期建立一种 -- 高产菌快 速筛选的新方法 5

!
!" !

材料与方法
菌种

高山被孢霉 6 !"#$%&#&’’( (’)%*( 7 C$! , 由本实 验室从土壤中分离,经荷兰 9DE 鉴定 5 高山被孢 霉 C0#、 鲁氏毛霉 F!0 由本实验室从土壤中分离, -GH!$#0 购买自武汉大学菌种保藏中心 5 菌种于

#
#" !

结果与分析
最佳染色条件的确定 通过对高山被孢霉 C$! 菌体进行 889 染色

第"期



敏等: 高山被孢霉的红四氮唑染色程度与菌体油脂中花生四烯酸含量的关系

!"#

时的缓冲液 $%、染色时间和 &&’ 的浓度的实验 表明 &&’ 缓冲液最佳的是 $% () * 研究, 结果见图#, 的硼酸缓冲液;菌体染色程度随染色时间延长而

增加, 但染色时间达到 # + 后染色程度增加较少; 最佳 &&’ 浓度为 *) (, ) 因此,随后的实验选择 最佳染色条件进行 )

图!

高山被孢霉 "#$ 菌体 %%& 染色时优化条件的确定 ( 染色程度通过 ’()* +, 来定量 )

染色时间对染色程度的影响; -: &&’ 溶液的 $% 对染色程度的影响; .: ’: &&’ 浓度对染色程度的影响 -./0 ! 12324,.+53.6+ 67 382 693.,5: ;6+<.3.6+= 67 ,>;2:.5 67 !"#$%&#&’’( (’)%*("#$ =35.+2< ?> %%& -: /00123 40 $% 40 3+1 &&’ 54673849 49 53:8989; <1;=11 >7:938081< ?@ "(A 9B :?54=?:921 C 8927?:3849 38B1 D:5 # +E &&’ 249219F 3=:3849 D:5 *) ", G ; .: /00123 40 8927?:3849 38B1 49 53:8989; <1;=11 C $% () *E &&’ 2492193=:3849 D:5 *) ", G ; ’: /00123 40 &&’ 2492193=:3849 49 53:8989; <1;=11 C $% () *E 8927?:3849 38B1 D:5 # + G )

#0 #

高山被孢霉 "#$ 种子菌体和发酵菌体的 %%& 染色分析 有活力的种子是大规模发酵所需的,而目前

在发酵培养基中培养比在种子培养基中培 养时高山被孢霉 IH! 能产生更多的油脂和 --) 发酵培养基中培养的菌体经 &&’ 染色来进一步 考查染色程度与菌体中油脂含量和油脂中 -- 含 量的关系 ) 结果如图 ") 结果表明, 随着培养时间 的增加,菌体的 &&’ 染色程度、菌体中的油脂含 量以及油脂中的 -- 含量都增加 )

种子活力的评价往往根据最终 -- 的产量,是一 个很费时间的过程 ) 因为 &&’ 广泛用于植物细 胞和组织的活力测定, 所以本研究利用 &&’ 染色 的方法来考察高山被孢霉的种子能否根据其染 色程度判断其接种后的 -- 合成能力 ) 种子染色 程度与种子培养时间即种龄的关系见图 H) 结果 显示染色程度随种龄增加而增加 ) 根据我们以 前的实验结果,种龄为 ! < 的种子最有利于花生 四烯酸的生产,获得的 -- 产量最高 ) 可见种子 的 &&’ 染色程度与最终的 -- 产量不相关 ) 尽管种子的 &&’ 染色程度与最终的 -- 产量 不相关,&&’ 染色程度随种龄增加是否与种子中 其他方面的变化有关呢?经对种子菌体的油脂和 油脂中 -- 含量随种龄的变化的测定 ( 图 !) 发现 种子菌体的油脂和油脂中 -- 含量随种龄的增加 而增加 ) 比较图 H 和图 !, 种子的 &&’ 染色程度、 种子中的油脂含量以及油脂中花生四烯酸含量 随种龄的变化曲线相似 )

图 # 高山被孢霉 "#$ 种子在不同种龄时的染色程度 -./0 # @35.+.+/ <2/422 67 %%& .+ .+6;A:A, ,>;2:.5 67 !"#$%&#&’’( (’)%*( "#$ 53 <.77242+3 .+6;A:A, 5/2

!"#













#$$" 年

图;

高山被孢霉 9:; 种子在不同种龄时菌体中

的油脂含量和油脂中的 $$ 含量 <+-= ; @+7+.5 +, ./3 &+02%55 01 +,04>’>2 %,. $$ +, ’+7+.5 %* .+11(/(,* +,04>’>2 %-( 01 !"#$%&#&’’( (’)%*( 9:;

图8

高山被孢霉 9:; 菌体中的油脂含量、 油脂中的 $$ 含

量和 ""# 染色程度的发酵过程曲线 <+-= 8 "+2( 40>/5(5 01 ’+7+.5 +, ./3 &+02%55? $$ +, *6( ’+7+.5 %,. 5*%+,+,- .(-/(( 01 ""# +, !"#$%&#&’’( (’)%*( 9:;

为了进一步研究菌体的 BBC 染色程度是与 菌体中的油脂含量相关还是与油脂中的 // 含量 相关,本文采用三株具有相似油脂含量和不同 // 含量的高山被孢霉菌以及一株不产 // 的鲁 氏毛霉进行 BBC 染色分析 ; 结果 ( 表 =) 显示菌体
表! "%&’( ! %&’()* !"#$%&#&’’( (’)%*( ?#! !"#$%&#&’’( (’)%*( ?=$ !"#$%&#&’’( (’)%*( 4!= !+,"# #"+-%(*+. /@A!#$=

BBC 的染色程度与菌体中的油脂含量无关 ; 而菌 体的 BBC 染色程度与 // 含量具有正相关性, // 含量高的菌株 BBC 染色程度深,而不含 // 的鲁 氏毛霉则不被染色 ;

不同菌株菌体的 ""# 染色程度、 菌体中的油脂含量与油脂中的 $$ 含量

)*%+,+,- .(-/(( 01 234(’+% 01 .+11(/(,* 5*/%+,5 %,. *6(+/ ’+7+. 40,*(,* %,. $$ 40,*(,* %&()*)*+ ,-+’-- . /"01 *2 3 $; 0<= $; !#1 $; "># $ 4)5), )* ,’6 7)82(99 !<; 1 !0; # !>; < !"; $ // )* :)5),9 !A; < =<; = #0; " $

;

讨论
BBC 的还原被经常用来作为生物体的活力的

化酶 F A G , I)JE 等报道则认为是在脱氢酶尤其是呼 吸链的复合体 K F =$ G ; 高山被孢霉是产生 // 的菌 种,其中有着众多的脱氢酶,尤其有着一类特殊 的脱氢酶 L 脂酰脱饱和酶,它们催化脂肪酸的双 键形成, 本文的研究表明菌体的 BBC 染色程度与 菌体油脂中的 // 含量正相关,而且不产生 // 的毛霉并不能染色, ’ 1 脂酰脱饱和酶是 // 合 成途径上关键的酶,它催化二高 ! 亚麻酸在 1 位 脱饱和形成 //,高山被孢霉菌体的 BBC 染色程 度与菌体油脂中的 // 含量有关是否表明该酶就 是 BBC 反应的酶需要进一步的研究 ; 本研究关于高山被孢霉菌体的 BBC 染色程 度与菌体油脂中的 // 含量呈正相关的发现有助

生化指标 ; 各种生物的 BBC 染色条件并不相同, 一般植物细胞和组织的 BBC 染色需要 =0 D #$ E, 而对于高山被孢霉染色 = E 即可获得稳定的染色 程度, 海藻的 BBC 染色时间与高山被孢霉类似 ,
F0G

可能与海藻和高山被孢霉所生长的环境有关 H 从 而其细胞的透性比植物大 ; 一般认为 BBC 是由脱氢酶还原的 ; BBC 被活 细胞吸收, 与脱氢酶释放的氢原子作用而被还原 ; 有些研究认为 BBC 是电子传递链的人工电子受 体 ; BBC 还原的位点有的报道认为在细胞色素氧

第"期



敏等: 高山被孢霉的红四氮唑染色程度与菌体油脂中花生四烯酸含量的关系

!"!

于高产 ## 菌的筛选 $ 有一些报道研究了 ## 高 产菌的筛选 $ 因为阿司匹林是 ## 进一步代谢形 成前列腺素的环加氧酶的抑制剂,阻断 ## 的降 解去路, 所以 %&’()*+ , -- . 利用含阿司匹林的培养基 选择性的筛选了产 ## 的被孢霉菌株,并获得三 株油脂中 ## 含量超过 "/0 的被孢霉菌株 $ 一 般认为能产生多不饱和脂肪酸的真菌可以在较低 的温度下生长,因为细胞膜中的多不饱和脂肪酸 越多, 膜的流动性越好, 从而能抵抗冷的环境 $ 因 此 低 温 筛 选 成 为 筛 选 ## 高 产 菌 的 常 用 方 法 , 1)2+ 等 , -3 . 在-/ 4 的温度下筛选到一株油脂中含 而 :’;)< 等 , ! . 报 ## 达到 "3$ "0 的菌株 567*89" , 道了在 = 4 的温度下筛选 ## 产生菌的方法 $ 但 无论采用哪种筛选方法,在分离获得大量菌株后 都需要进行油脂中 ## 含量的测定以寻找其中的 高产菌株, 这是一个非常耗时的工作, 包括菌体干 燥、油脂提取和气相色谱分析等 $ 本文的研究结 果将有助于快速判断菌体中的 ## 含量,从而加 快 ## 高产菌的筛选 $ 参考文献( !"#"$"%&"’) (
,-. >?@@ ?A B#@?B%CD E$ F’GH6+(<;6&<;2I J<;;H <K*I(A L<&; ?M ’KK6&&2+K2A N*’G’O*K<G <K;*P*;*2( <+I <LLG*K<;*’+ , Q . $ C&2+I( :*’;2K)+’GA -RRSA -=M "/-8"/R$ :E?1T % %A >#EU?%@V WA 9XUUY#Z V EA !" #$$ # &<+8 I’[*\2I K’+;&’GG2I ;&*<G ’J 2<&GH I*2;<&H (6LLGH ’J G’+O K)<*+ L’GH6+(<;6&<;2I J<;;H <K*I( <+I [2+;<G I2P2G’L[2+; *+ ;2&[

,3.

*+J<+;( , Q . $ V2P Y2I 1)*GI Z26&’GA 3///A "3M -S"8-]-$ :XC9# #A F#^@ ?A EX^_ 1A !" #$$ #+ *(’G<;*’+ L&’K2I6&2 J’& <&<K)*I’+*K <K*I L&’I6K*+O %&’"(!’!$$# (L2K*2( , Q . $ #+;’+*2 P<+ @226‘2+)’2aA -RRRA S=M 3=!83=b$ ,". c9^ YA D^ @ QA 5^ D _$ #+ *+2dL2+(*P2 [2I*6[ J’& L&’8 I6K;*’+ ’J <&<K)*I’+*K <K*I NH %&’"(!’!$$# #$)(*# , Q . $ Q ?+I Y*K&’N*’G :*’;A 3//!A !/M S=8SR$ ,=. 9^#Z> D W$ ?I2+;*J*K<8 TZ^CcXZ V W,C9^EYXZV Q Y, ;*’+ ’J ’=8V2(<;6&<(2 J&’[ %&’"(!’!$$# #$)(*< NH )2;2&’G’O’6( 2dL&2((*’+ *+ :<a2&( e H2<(; <+I K<+’G< , Q . $ Q :*’G 1)2[A : "= ) 3R!b/83R!bb$ -RR]A 3S! ( ,b. F#@C# Q FA @%B?CC QA WC#V%@Y#ZZ % Q$ FG<+; P*<N*G*;H <((<H , Q . $ 1&H’N*’GA -RS]A -=M 3"R83==$ , S . E^T@?W9# YA F#%>@% @$ Y2;<N’G*K JG6d2( <+I @8GH(*+2 (H+;)2(*( NH +&’,*!-#."!’(/0 1$/"#0(./0 *+ &2G<;*’+ ;’ K2GG6G<& ;’;<G &2I6K*+O <K;*P*;H , Q . $ F&’K2(( :*’K)2[A 3//-A !bM -3!!8 -3"/$ ,]. !" #$$ f6<+;*;<;*P2 P*<N*G*;H ’J Z#Y : 9A Q?Z 9 QA T?Y W T , (2<‘22I ;*((62( <((2((2I ‘*;) 3A !A =;&*L)2+HG;2;&<\’G*6[ K)G’8 &*I2 , Q . $ Q #LLG F)HK’GA -RR]A -/M !-8!b$ , R . Y^WW%E V #A XW%EXUU # E$ C)2 6(2 ’J ;2;&<\’G*6[ (<G;( ;’ I2;2&[*+2 (*;2( ’J I<[<O2 ;’ ;)2 [*;’K)’+I&*<G 2G2K;&’+ ;&<+(8 L’&; K)<*+ *+ *+;<K; K2GG( J’GG’‘*+O (* 2("’& L)’;’IH+<[*K ;)2&<LH ‘*;) L)’;’J*+ ?? , Q . $ F)’;’K)2[ F)’;’N*’GA -RR"A =RM b3-8b3b$ , -/ . E?19 F EA Y?W19?W @ #A F^ECXZ W , !" #$$ C)2 (*;2( ’J *+;2&<K;*’+ ’J ;&*L)2+HG;2;&<\’G*6[ K)G’&*I2 ‘*;) [*;’K)’+I&*<G &2(L*&<;’&H K)<*+( , Q . $ U%YW Y*K&’N*’G @2;;A 3//-A 3/3M -]-8 -]S$ , -- . %EXW9?Z B TA V%VD^T9?Z# % >A 19?WCD#TXB# C ?A !" #$$ #&<K)*I’+*K8<K*I L&’I6K;*’+ NH (L2K*2( ’J %&’"(!’!$$# , Q . $ 5’&GI Q Y*K&’N*’GA -RRbA -3M R-8Rb$ , -3 . 19%Z 9 1A 19#Z> 1 1A 19%Z 1 _$ XL;*[*\<;*’+ ’J <&<K)*I’+*K <K*I L&’I6K;*’+ NH %&’"(!’!$$# #$)(*# 567*89" *(’G<;2 , Q . $ Q #[ X*G 1)2[ W’KA -RRSA S"M =bR8=S]$ ,!.

g 上接第 !-! 页 h
,3. X>XC F 9A %V%@Y#ZZ #A T?EW19 WA !" #$$ 96[<+ D K)&’[’(’[2 <\’’(L2&[*< J<K;’& g #cU h [<LL2I ;’ I*JJ2&2+; -RRbA =M R!!8R"!$ (6N&2O*’+( *+ Di-- , Q . $ 96[ Y’G >2+2;, W^Z 1A WT#@%CWTD 9A :?EE%Z :A !" #$$ #+ <\’’(L2&[*K [<+ ‘*;) < I2 +’P’ L’*+; [6;<;*’+ *+ ;)2 D8K)&’[’(’[<G O2+2 ^WFRD , Q . $ Z<; >2+2;A -RRRA 3!M "3R8"!3$ Y1%@E%#B%D TA TE#^W% 1$ Y<G2 *+J2&;*G*;H <+I ;)2 D -RRRA b"M R3]8R!!$ K)&’[’(’[2 , Q . $ #[ Q 96[ >2+2; , C#T%^19? #A Y?W9?Z# DA Y?D#?W9? XA !" #$$ 92;2&’\HO’(*;H ‘*;) &2(L2K; ;’ cJL-"] K<6(2( K’[LG2;2 G’(( ’J J2;<G O2&[ K2GG( I6&*+O [’6(2 2[N&H’O2+2(*( , Q . $ Z<; >2+2;A 3//!A !! g 3 h M -S38-Sb$ U@#Z#>#Z QA 9%#@%D WA DX^Z> QA !" #$$ #+<GH(*( ’J ;)2 ;&<+(K&*L;*’+ &2O6G<;’&A 1ZXCSA <( < K<+I*I<;2 K)&’[’(’[2 ] ;6[’& (6LL&2((’& O2+2 *+ K’G’&2K;<G K<+K2& , Q . $ ?+; Q 1<+K2&A 3//!A -/b g " h M =/=8=/R$ Z#T#Y^E# CA D#X EA X>#5# CA !" #$$ XG*8 O’8<(;)2+’8;2&<;’\’’(L2&[*< *+ [*K2 G<Ka*+O 1+’;SA < &2O6G<;’& ’J &2;*+’*I _ &2K2L;’& N2;< , Q . $ Z<; >2+2;A 3//"A !b g = h M =3]8=!!$ W19%^E@% VA V%DX^Z> Y FA :?ZZ?Z>%E V YA !" #$$ 1<+K2& O2+2 I*(K’P2&H 6(*+O I*O*;<G I*JJ2&2+;*<G I*(LG<H , Q . $ 3///A b/ g -= h M "/!S8"/"!$ 1<+K2& E2(2<&K) , 9^:#ZT YA W19#Cc V 1$ ?I2+;*JH*+O I*JJ2&2+K2( *+ [EZ# 2dL&2((*’+ NH &2L&2(2+;<;*’+<G I*JJ2&2+K2 <+<GH(*( ’J KVZ# , Q . $ Z6KG2* #K*I( E2(2<&K)A -RR"A 33 g 3= h M =b"/$ BXZ WC%?Z X VA C9?%W 5 >A 9XUY#ZZ Y$ # )*O) ;)&’6O)L6; (K&22+*+O J’& &<&2GH ;&<+(K&*N2I I*JJ2&2+;*<GGH 2d8 L&2((2I O2+2( , Q . $ Z6KG2* #K*I( E2(2<&K)A -RRSA 3= g -! h M 3=R]$ @?#Z> FA F#E#V%% # :$ V*JJ2&2+;*<G I*(LG<H ’J 26a<&H’;*K [2((2+O2& EZ# NH [2<+( ’J ;)2 L’GH[2&<(2 K)<*+ &2<K;*’+ , Q . $ WK*2+K2A -RR3A 3=SM RbS$ 5%@W9 QA 19#V# TA V#@#@ W WA !" #$$ #&N*;&<&*GH L&*[2I8F1E J*+O2&L&*+;*+O ’J EZ# , Q . $ Z6KG2* #K*I( E28 (2<&K)A -RR3A 3/ g - h M "Rb=$ C#T%^19? #A Y?W9?Z# DA Y?D#?W9? XA !" #$$ 92;2&’\H8 O’(*;H ‘*;) &2(L2K; ;’ 34)-"] K<6(2( K’[LG2;2 G’(( ’J J2;<G 3//!A O2&[ K2GG( I6&*+O [’6(2 2[N&H’O2+2(*( , Q . $ Z<; >2+2;, !! g 3 h M -S38-Sb$ 5%? DA T#C9@%%Z 9A @#Z> YA !" #$$ ?I2+;*J*K<;*’+ ’J 34)5 65 A < O2&[ K2GG8(L2K*J*K O2+2 2+K’I*+O < +’P2G \*+K J*+8 g --] h M O2& L&’;2*+ , Q . $ Y2K)<+*([( ’J V2P2G’L[2+; , 3//3 , 3!!83!R$

,R.

,!.

, -/ .

,". ,=.

, -- .

, -3 .

,b.

, -! .

,S.

, -" .

,].




友情链接: 时尚网 总结汇报 幼儿教育 小学教育 初中学习资料网