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精选PCR引物设计及PrimerPremier50使用介绍资料_图文

PCR引物设计及相关软件使用

主要内容
? PCR介绍 ? 引物设计原理 ? 引物设计的优化原则 ? Primer Premier 5.0 介绍 ? 举例说明引物的设计

PCR介绍
1、什么是PCR
2、PCR的组成
3、如何提高PCR成功率 (定量,对照)

引物设计原理
引物设计的目的是为了找到一对合适的 核苷酸片段,使其能有效地扩增模板 DNA序列。引物设计总体上包含三个程 序:序列下载,同源性比较,引物设计 筛选 。

引物设计的原则
1、引物长度
大多数应用的最短引物长度为18个核苷 酸。如果期待的产物长度等于或小于 500 bp,选用短的(16~18)的引物;若 产物长5 kb,则用24个核苷酸的引 物。有人用20~23个核苷酸引物得到 40 kb的产物。

引物设计的原则
2、引物GC含量
GC含量在40%-60%之间,以45-55% 为宜。这可为有效退火提供足够热。

引物设计的原则
3、引物Tm
引物所对应模板序列的Tm 值最好72℃ 左右。至少要在55-80℃之间。 Tm=2(A+T)+4(C+G)

引物设计的原则
4、引物3’端
? 引物3’末端和模板的碱基完全配对 ? 防止一对引物内的同源性 ? 考虑末端5个碱基的ΔG ? 引物3′端要避开密码子的第3位

引物设计的原则
5、引物序列与模板序列组成的相似性
可能的错误引发位点决定于引物序列组 成与模板序列组成的相似性,相似性高 则错误引发率高 。

引物设计的原则
6、最好在模板cDNA的保守区内设计
DNA序列的保守区是通过物种间相似序 列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物 种的同一基因,通过序列分析软件(比 如DNAman)比对(Alignment),各 基因相同的序列就是该基因的保守区。

引物设计的原则
7、引物自身及引物之间不应存在互补序 列
引物自身不应存在互补序列,否则引物 自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引 物本身复性。这种二级结构会因空间位 阻而影响引物与模板的复性结合。

引物设计的原则
8、碱基要随机分布
引物序列在模板内应当没有相似性较高, 尤其是3’端相似性较高的序列,否则容 易导致错误引发(False priming)。

引物设计的原则
9、引物应具有特异性
引物设计完成以后,应对其进行检测。 如果与其它基因不具有互补性,就可以 进行下一步的实验了。

引物设计的原则
10、ΔG值 ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的 强弱程度。一般情况下,引物的ΔG值最 好呈正弦曲线形状,即5’端和中间ΔG值 较高,而3’端ΔG值相对较低,且不要超 过9(ΔG值为负值,这里取绝对值), 如此则有利于正确引发反应而可防止错 误引发。

引物设计的原则
11、引物的5′端
引物的5′端可以修饰,而3′端不可修饰, 引物5′ 端修饰包括:加酶切位点、标记 生物素、荧光、地高辛等;引入蛋白质 结合DNA序列;引入点突变、插入突变、 缺失突变序列;引入启动子序列等。

引物设计的原则
12、在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳 定(如GC含量较多),而3′末端不太稳定 (如AT含量较多)的引物

Primer Premier 5.0 简介
主要功能:
1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析

Primer Premier 5.0使用介绍 Load sequence
Preimer Premier 启动界面

基本信息

Original sequence

Sequence name

Choose a function

Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a
protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好

引物设计界面 First you can design the primer manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer

引物搜索选项设定
引物类型

搜索模式

引物长度

5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围

28对引物
引物分值 100分为满分

搜索结果
每对引物的信 息

双击选中一对 引物

回到主窗口
引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross
dimer

一对理想的引物应当不存在任何一种上述结 构,因此最好的情况是最下面的分析栏没有
But …

引物编辑

引物编辑
Edit primer here
Analysis the edit result
Accept the edit result Return to the main window

举例说明
任务
用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1

Plasmid 1:

BamHI

SP

NR1

Plasmid 2

pcDNA3.1 GFP

GFP

BamHI(GGATCC)

SP

NR1-1a

pcDNA3.1

NR1的编码序列(~4000bp)
121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa
红色为信号肽, 蓝色为BamHI酶切位点, 下划线标出酶切位点的阅读框

GFP序列(~700bp)
ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT
GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAA

引物要求
? PCR扩增GFP ? GFP两边添加BamHI酶切位点 ? 保证NR1的阅读框不改变

第一步:扩增GFP基本序列
GFP序列
5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ 3’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’
变性, 引物复性
5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ ………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’ Primer2
Primer1: 5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………… 3’ TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5’

Primer1: 5’ Primer2: 5’

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………….. TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….

Primer1: 5’ Primer2: 5’

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………….. CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….

第二步:GC比值;Tm值

Primer1: 5’ Primer2: 5’

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA………….. CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….

Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA (GC:60%,Tm:64) Primer2: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGCC (GC:57%,Tm:66)

第三步:酶切位点

BamHI: ggatcc

Primer1: 5’ Primer2: 5’

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA (GC:60%,Tm:64) CTTGTACAGCTCGTCCATGCC (GC:57%,Tm:66)

Primer1: 5’ ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5’ ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC

第四步:阅读框
NR1序列: atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct…..
Primer1: 5’ ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
Primer1: 5’ ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

NR1序列:
atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct
GFP序列
5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’
插入GFP后的组合序列
cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC ………………………… …TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG ??ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct

Primer2: 5’ ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC Primer2: 5’ gg atc cct CTTGTACAGCTCGTCCATGCC

第五步 保护序列
Primer1: 5’ GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
Primer2: 5’ GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC




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