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爱普列特治疗老龄大鼠前列腺增生症作用机制的初步研究

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温州医学院 硕士学位论文 爱普列特治疗老龄大鼠前列腺增生症作用机制的初步研究 姓名:吴伟 申请学位级别:硕士 专业:临床检验诊断学 指导教师:陶志华 20090501

温州医学院硕士学位论文

爱普列特治疗老龄大鼠前列腺增生症作用机制 的初步研究
中文摘要
目的 研究爱普列特作用后,老年大鼠5a.还原酶mRNA表达的变化及其对微血管,
细胞凋亡等方面的作用,评价新型50t-还原酶抑制剂爱普列特对老龄大鼠前

列腺组织的影响,重点探讨50t-还原酶抑制剂对治疗良性前列腺增生症的作 用机制,为治疗前列腺增生症的药物选择提供理论基础。 方法 1.选取清洁级实验动物70只雄性15月龄老年SD大鼠,体重540±209,
均由浙江省实验动物中心提供,所有动物为SPF级动物。将老龄SD大鼠分 为四组:大剂量组(A组):SD大鼠20只,灌胃口服爱普列*ǎ常恚纾耄纾保洹#保 周;d,N量组(B组):SD大鼠20只,灌胃口服爱普列*ǎ保恚纾耄纾保洹#保

4周;药物对照组(C组):SD大鼠20只,灌胃口服保列治片(1mgkg-I.d-1)4
周;空白对照组(D组):SD大鼠10只,灌胃口服生理盐水4周。 2.5a-还原酶mRNA检测:通过荧光定量PCR法检测前列腺组织中5a-还原 酶mRNA相对表达量,观察不同类型的5a-还原酶抑制剂对50【.还原酶mRNA 表达的作用。 3.细胞凋亡蛋白检测:免疫组化法检测前列腺组织中Bax,Bcl-2蛋白表达, 观察5m还原酶抑制剂作用前后细胞凋亡蛋白表达量的改变。 4.微血管相关蛋白测定:免疫组化法检测前列腺组织中eNOS蛋白表达,观 察用前列腺组织在用药前后微血管生长相关蛋白表达的变化。

5.前列腺组织微血管密度测定:CD34蛋白表达于前列腺组织中微血管内皮, 经免疫组化染色后,镜下计算每视野下微血管数目,观察前列腺组织在药物
作用前后微血管密度的变化。

6.统计学处理:采用SPSSll.5统计学软件,将所得计量数据采用one.way
ANOVA,显著性水*P<0.05。

结果
1.各实验组5ct-还原酶mRNA表达变化: 用实时荧光定量PCR检测前列腺组织中1型5a.还原酶mRNA与2型5仅.还 原酶mRNA表达,实验结果显示:药物治疗组中l型5a.还原酶mRNA(A组,

温州医学院硕士学位论文 B组与C组)与正常组(D组)之间的表达量无明显差异(11.49士1.487,454-2.31,
vsl

1.2l士1.75,P>0.05),同样,2型5仅.还原酶mRNA(A组,B组与C组)

与正常组(D组)之间的表达量也无明显差异(6.32土o.84,7.034-0.67vs6.82 士o.45,g>0.05),表明老龄大鼠经短期小剂量的5a还原酶抑制剂(爱普列特)

治疗后,其前列腺组织中5迩原酶mRNA的表达量并未发生明显变化,可 推测短期小剂量的5密原酶抑制剂(爱普列特)只能通过抑制5a还原酶的活
性以减少睾酮向双氢睾酮的转化来减小前列腺的体积,而不是抑制5a还原酶 mRNA表达量减少。 2.细胞凋亡蛋白Bcl.2和Bax蛋白表达变化: 利用免疫组化法检测前列腺组织中Bcl-2和Bax蛋白表达,结果显示:与正 常组(D组)相比,各用药组(A组、B组和C组)Bcl-2蛋白表达量明下降

(尺O.05),而Bax蛋白表达升高(P<0.05)。因此,Bax/Bcl-2比值升高(尺O.05).
以上结果表明,5ai丕原酶抑制剂(爱普列特)对老龄大鼠前列腺增生组织中 凋亡蛋白的表达有明显的作用,可能呈剂量依赖性,但由于实验组间爱普列 特灌服剂量差异较小, 但不具有统计学意义。 3.各实验组微血管密度和eNOS蛋白变化的比较结果: 免疫组化法检测前列腺组织中CD34的表达,同时计算前列腺组织中微血管 凋亡蛋白表达在大d,N量组之间虽然有部分差异,

密度(姗),发现用药组(A组、B组和C组)的MVD值明显低于正常
爱普列特大剂量组(A组)的MVD值明显低于爱普列特小剂量组(B组)

组(D组)(4.354-2.20,6.254-1.29,4.904-1.29vs8.00±2.98,尺O.05),而且
(4.35±2.20vs6.254-1.29,P<0.05);在对微血管生长相关蛋白eNOS检测中 发现A、B、C组eNOS蛋白表达量明显低于D组(72.27±48.50,163.89±91.40,

144.824-80.78vS293.58±116.0,只O.05),A组明显低于B组(72.27±48.50
vsl63.89±91.40,P<0.05)。表明爱普列特对微血管生长有明显抑制作用, 并呈现剂量依赖性。

结论:
1.爱普列特可能对前列腺增生组织中5毡还原酶mRNA的表达无明显影响。 2.爱普列特可以显著上调大鼠前列腺组织中凋亡促进蛋白Bax的表达,下调凋 亡抑制蛋白Bcl-2的表达,促进前列腺增生组织细胞凋亡的发生。 3.爱普列特对前列腺增生组织eNOS蛋白表达也有显著抑制性作用且MVD值

有明显改变,能起到减少前列腺增生中微血管密度的作用。

关键词:爱普列特:保列治;前列腺增生;5斑原酶mRNA;Bcl-2;Bax

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Preliminary Study

011

Therapeutic Mechanism ofEpristeride

in Treating Benign Prostatic Hyperplasia Disease in Aged

Maie

Rats

Abst ract
OB朋Ⅸ了ⅡvE:After the thempeutic action of epritseride(the new type of mductase
effect
on

5alpha-

inhibitor),we
microvessel

observe the expression of 5alpha-reductase mRNA and its

and cell
on

apoptosks.Evaluate the effect of the new type of
the prostate tissue of aged male rats.The mechanism
on

5alpha—reductase

inhibitor

of

epritseride’S therapeutic effect

the benign prostatic hyperplasia was discussed principle of medication to benign prostatic

emphatically.Finally,the hyperplasia.

theoreticaI

METHODS:
1.Seventy healthy SD divided into four

rats(male,15

month's age,weighed

540a:209)were

randomly with dose

groups:hi曲dose group(Group A):20
administration,for with 20

rats,treated days;low

EpritSeride(3 mgk91.d‘1),intragastrie group(Group B):20rats,treated

Epritseride(1 mgkffl.d-1),intragastric
rats,treated

administration,for 20 days;control

group(Group C):20
20 days;blank

with(1mgk91.d-
with

1),intragastric administration,for

group((3roup D):10rats,treated

norma l s“11’intragastric administration,for 20 days.

2.The

detection of 5alpha-reductase

mRNA:Real-time

fluorescence quantitative PCR

rneathod was used to detect the 5a-reductase mRNA expression in prostate observe the different types of 5a-reductase inhibitors
on

tissues.To
of 5a-

the

expression

reductase mRNA. 3.The detection of apoptosis proteins:immunohistochemistry meathod was used to detect Bcl-2,Bax protein

expression

in prostate tissues.to observe the role

of

5a-

reductase inhibitors

of

apoptosis protei n expression before and after.

4.The detection of micmvessel assosiated proteirL immumhistochemistry meathod
was

used

to detect

eNOS protein

in prostate tissues.to observe the

changes

in

volume
5.The

ofmicrovessel-related protein in prostate tissues. detection of microvessel density in prostate tissues:CD34 was expressed in

prostate tissues。microvessel endothelium.Aider staining of immunohistochemistry, to count

the number ofmicrovessel density in microscopy,to invaluate the changes
or

of microvessel density before 6.Statistical

after medication

treatment

in prostate tissues.

analysis:Us吨SPSS

1 1.5 stastistical sofeware,all the

experiments

were

.3.

温州医学院硕士学位论文
performed through using One-way ANOVA,P<O.05 gas considered significa nt.

statistically

RESU吣:
1.The changes of The type

5alpha-reductase

mRNA expression in rat prostate tissues

1 and type 2 5ct-reductase mRNA expression were detected by real-time

fluorescence quantitative PCR,the levels between the drag

experimental

results showed that the group B and group

expression
norma 1

treatment group(group A
significant
difference

C)and

group(group D)have
dose of 5a reductase

no

p O.05),because

of short-term low-

inhibitors(Epristeride)treatment,the


5a reductase

mRNA

expression

of BPH tissue

in all groups was not changed

significantly.tO

predict short

term and small dose 5a?reductase inhibitors only

throu曲the

inhibitor the activity of

5a-reductase inhibitors to decrease the tramform of testosterone to dihydrotesterone ,in order to deminish the vol ume of prostate,not through inhibite the decrease 5a- reductase inhibi tors mRNA expression. 2.the changes of Bcl-2,Bax protei n expression in all groups. Detected by immunohistochemistry Bcl-2,Bax protein expression in aged prostate tissues showed that compared with the

male

rat

norma l group(group D),the
A,group B and group

expression
decreased

of Bcl-2 protein in treatment

group(group



significa ntly‘氏O.05),however,Bax protein expression increased(氏0.05).
of Bax/Bcl-2
on

Therefore,the ratio
Epristeride play


increased(尸<O.05).These

results suggest that

great role

the expression of apoptosis proteins in aged

male

rats,

may

be



dose-dependent manner,and because

Epristeride孕vage expression

dose discrepancy

WaS less in group A and group B,apoptosis protein differences

although there are

some
all

between,but

have

no

statistical

significance.
eNOS protein

3.The

results

of Microvessel

density and the

changes

in

experimental groups:

Detected

the

expression

of CD34 by immunohistochemistry in prostate tissue,while

the calculation of prostate

tissue

microvascular

density(MVD),We

found that the

treatment group(groupA,group B and group

C)WaS

significantly lower than the

MVD

Group(group

D)(4.35
the

4-2.20,6.25

4-1.29,4.90±1.29vs8.00±

2.98尸<0.05),Moreover significantly

MVD value

ofEpristeride large dose

group(group A)was group(group B)

lower than the

MVD value

of Epristeride low-dose found that

(4.35±2.20rs6.25±1.29,P<O.05);We also
of

the eNOS protein expression

group凡B,C

was significantly lower than group

D(72.27±48.50,163.89±

.4?

温州医学院硕士学位论文 91.40,144.82±80.78vs293.58±116.0,尸<O.os)by
detecting microvascular growth

associated protein eNOS.Group A was significantly lower than group

B(72.27±

48.50vsl63.89±91,40,尸<o.05).It

shows that Epristeride

can

obviously inhibit

microvessel growth.Also it seems to be dose—dependent.

CoNCUJSIoNS:
1.Epritseride mRNA seems IX)effect
on

the expression of two types

of

5alpha—reductase

in aged ma le rats.
call

2.5alpha—reductase inhibitor of Epritseride

reduce the protein

expression

of Bcl--2

protein,but it may seems increase the protein expression of Bax protein. 3.F.pritseride could effectively inhibit the expression of eNOS protei n in the aged 残眈prostate tissue and reduce concerned with the effect

ma le

the microvessel density,the degree of inhibition was dose

of

Epritseride,which

thereby

could

suppress

angiogenesis ofcapillary in the ventral prostate of rats.

KEY WORDS:epristeride;finasteride;BPH;5ct-reductase

mRN&bcl--2;bax

.5.

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学位论文独创性声明

本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知,除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要 贡献的个人和集体,均已在文中作了明确说明并表示谢意。
作者签名:

爱彳韦

日期:

卅◆z气

关于学位论文使用授权声明
本人完全了解温州医学院有关保留、使用学位论文的规定,学校 有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子 版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文 进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行 检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解 密后适用本规定。


学位论文作者签名:

象/i彳7



导师签名:c文




飙d川、s。1

期:

卵小,尹

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随着生活水*的提高和人均寿命的延长,前列腺增生(benign
高的趋势。前列腺增生所引起的下尿路症状(Lower

prostatic

hyperplasia,BPH)作为中老年男性的常见病和多发病,其发病率正在呈逐年增
urinary tract symptom,LUTS)

严重影响中老年人的生活质量。在中国,BPH曾经是极少见的病,根据1936年 北京协和医院报告,40.70年龄段组织学前列腺增生发生率分别为2%、12%、

10%、20%。而最*北京大学泌尿外科研究所的尸检报告则显示㈨1,40-70年龄
段组织学前列腺增生发生率分别为13.2%、20%、50%、57.1%。顾方六嘲2等报

道,1997年全国187所医院BPH病人住院占16.1%(15459/59749),大多数医院 统计因BPH住院者较30年前增加了3倍以上。在国外资料中,McConnell‘33在
Campbdl’s

Umlogy中指出,41.50岁年龄段组织学前列腺增生为8%,51-60岁和

71.80岁年龄段分别为50%和90%。关于前列腺增生的确切病因目前尚未完全阐 明,但是随着对BPH病因及发病机制研究的不断深入,中老年人体内雄激素水
*,尤其是双氢睾酮(DHT)的变化在BPH发病机制中的作用正日益引起人们 的重视。

爱普列特是国家一类新药,*几年被用于治疗BPH。它是一种高选择、非竞
争性5a-还原酶抑制剂,在临床应用中发现爱普列特较传统的5a-还原酶抑制剂有 起效时间较短的特点,1989年Metcalf[43首次报道合成爱普列特的简讯。1990年 Holt[5]5详细描述了爱普列特的合成步骤。1996年完成I II期临床研究㈨6,2002年 完成Ⅳ期临床研究‘7j,1999年批准上市,爱普列特治疗BPH的机制是与5Ⅸ还原

酶及还原型辅酶II(N—虹)P+)形成稳定且不可逆转三元复合物,从而阻断睾酮 (T)向双氢睾酮(DHT)转变,进而抑制前列腺的增生。爱普列特可选择性和 专一性地抑制II型5a-还原酶,对1型5a.还原酶基本无亲和性嘲。SUN等‘93对BPH 老年狗和Beagle成年狗服用爱普列特后前列腺萎缩的机*醒芯浚⑾智傲
腺上皮细胞分别经180nmol/L和360nmol/L爱普列特处理后,前列腺赖以生长的

DHT急剧下降,前列腺生长的特异性指标PSA的合成、分泌严重受阻。爱普列 特II期和Ⅳ期临床研究结果表明,爱普列特是一种安全有效的治疗BPH的药物, 可显著改善患者的排尿症状,提高生活质量,缩小前列腺体积,增加尿流率,减 少残余尿,同时其在改善症状,缩小前列腺体积,改善最大尿流率方面要优于保 列治。国内李家泰等[1们对爱普列特人体耐受性研究显示,单次2.5rag-3.0mg药 物和5mg

2沩天,持续8天给药,均无有关的不良反应出现,表明爱普列特对

人体耐受性良好,然而目前对于爱普列特的研究还不多,许多问题如服药以后对 *及组织中性激素的影响,尤其是对前列腺组织中双氢睾酮(DHT)水*的变

温州医学院硕士学位论文 化;而此前本课题组吴海涵等‘113研究得出人在服用爱普列特1个月和3个月后 可以明显降低前列腺组织中双氢睾酮(DHT)水*,且服用3个月较服用1个月组 织中双氢睾酮(DHT)下降更为明显。服用保列治1个月和3个月后可以明显降低 前列腺组织中双氢睾酮(DHT)水*。且服用保列治3月较服用保列治1月组织 中双氢睾酮(DHT)下降不明显。 而5a-还原酶是影响双氢睾酮(DHT)代谢的关键酶。5a-还原酶目前发现存 在1型和2型。许多文献证明2型5a-还原酶,主要在生殖器组织表达,包括前列腺 组织。前列腺组织中的2型5Qt-还原酶活性对前列腺增生的发病起主要作用。但还 存在争论,有文献提出一型5a-还原酶也有在前列腺组织中表达,并且具有活性, 在前列腺增生的机制中起重要的作用。目前的2型5洳还原酶抑制剂再使用一段时 间后不能使前列腺进行性缩小,有学者推测,其原因可能在于1型50r-还原酶没有 很好的抑制。因此研究前列腺组织中的两种还原酶的表达,可能可以为前列腺的 发病机理及治疗提供参考。 由此,本研究则通过测定实验动物(老年大鼠)服用爱普列特一段时间后测 定前列腺组织中5a-还原酶mRNA表达,凋亡相关蛋白表达,微血管密度的变化, 血管相关蛋白eNOS表达,与正常组及空白对照组进行比较,并行非那雄胺*行 对照,研究爱普列特的对前列腺增生症的作用机制,为该药物的长期疗效及预后 提供参考。

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材料与方法
1.

实验动物 70只健康15月龄雄性SPF级SD大鼠,体质量(540-士20)g,购于浙江省

实验动物中心【使用许可证号:SCXK(浙2003-0001)],所有动物饲养于温州医学
院试验动物中心SPF实验室。分笼饲养,随意饮水,自由进食。 2.实验分组 采取随机区组设计,将实验共分为四组,正常组为10只,其它三组各20 只。A组为喂饲爱普列特大剂量组(3mgkga.d’1),B组为爱普列特小剂量组 (1mgkgq.d-1),C组为喂饲非那雄胺组(1mgkg-1.d’1),D组灌喂饲生理盐水。

灌服20天后断颈处死,完整切除前列腺组织。
3,主要仪器和器械 ABl04电子分析天*: SLAN全自动荧光定量PCR仪: 超净工作台: 瑞士Mettler公司 上海宏石医疗科技有限公司 苏州净化设备厂

紫外分光光度计HP8453:HP公司,德国 低温高速离心机03bfuge 28RS):Heraeus公司,德国 显微荧光照相系统(Nikon E.800): YDS一35.125型液氮生物容器: Olympus显微镜CX21: 手术器械: 电热恒温水浴箱: 日本Nikon公司 成都金凤液氮容器有限公司 日本奥林巴斯光学工业公司 北京市六一仪器厂 上海医疗器械五厂

高速低温台式离心机1-15K型:HrllOH.78532 微型旋涡混合仪(XW.80A型): 超净工作台: 微量移液器(Therrno Finnpipette): 酶标比色仪(318MC型): 压力蒸汽灭菌器: Haier海尔微波炉: 显微荧光照相系统(Nikon E-800):
Image—Pro Plus

温州上塘教学仪器厂 苏州净化设备厂 芬兰雷勃公司 上海沪国科学仪器有限公司 上海华线医用核子仪器有限公司 北京海尔公司 日本Nikon公司 美国Media Cybernetics公司

6.0图像分析软件:

4.主要试剂 爱普列特: 非那甾胺: 江苏联环制药厂

杭州默沙东公司

温州医学院硕士学位论文 戊巴比妥钠:
Triml:

上海西唐生物科技有限公司
invitroge公司 杭州长征化工厂 promega公司 杭州长征化工厂 杭州长征化工厂 西班牙biowest公司 上海生物工程有限公司 上海生物工程有限公司 TAKARA公司 美国HARRIS公司

氯仿: 逆转录酶M-MLV: 异丙醇; 无水乙醇: 琼脂糖: 引物: 探针:
1 00bp ladder DNA Mraker DL2000:

超低温冰箱(一70℃):
RevertAid
TM

First Strand cDNA

Synthesis Kit:

日本TAKARA公司
上海生物工程有限公司 美国丸b,GEN公司 promega公司 武汉博士德生物有限公司 北京中衫金桥生物技术有限公司

Dntp(1 0mM): 1.Sml、O.5ml、0.2mlEppendof管: Taq酶: CD34兔型多克隆抗体: eNOS兔型多克隆抗体: SABC试剂盒: 二甲苯(XYL): 兔SP检测试剂盒:

武汉博士德生物有限公司 武汉博士德生物工程有限公司 北京中衫金桥生物技术有限公司
武汉博士德生物工程有限公司 北京中衫金桥生物技术有限公司 北京中衫金桥生物技术有限公司 北京中衫金桥生物技术有限公司 北京中衫金桥生物技术有限公司

BSA封闭液:
苏木素: 磷酸盐缓冲液(PBS): 标准枸橼酸盐(SSC):

3,3’一二氨基联苯胺(DAB):
5.

标本采集和保存

按o.1ml/kg的剂量给动物注射10%戊巴比妥钠,等动物完全麻醉后,在超 净工作台下解剖大鼠,在病理科老师指点下在超净工作台下解剖大鼠,取出约
100mg的前列腺组织,放入已用DEPC水和高压处理过的2ml的可立冻存管中,

然后立即投入液氮罐中,在标本全部收集完成后,将液氮中的标本转入--70℃超 低温冰箱长期保存,待实时荧光定量PCR时取用,另取出每只大鼠的前列腺腹
侧叶的组织,将组织切成大致为lcmxlcmx0.3cm,放入盛有4%的多聚甲醛小青

霉*恐薪荼4妫玻葱∈保缓笏筒±砜剖癯て诒4妗 6.试剂配制

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(1)D日C水的配制: D四C
去离子水 37℃水浴
0.19 100ml 2h 20min

120"(2高压灭菌
(2)75%乙醇配制: 无水乙醇 去离子水 (3)D-Hanks液配制:
KCl NaCl

75m1 25ml

0.49 8.Og 0.359 0.159 O.069 1000ml 20min

NmC03
Na2HP04。1 2H20 KH2P04

去离子水 120℃高压灭菌

(4)柠檬酸缓冲液(PH 6.o):
柠檬酸三钠 柠檬酸 加蒸馏水定容至1000ml (5)PBS缓冲液(PH 7.2~7.4)-
NaCl 189 39 0.49

NaI--12P04 2H20

0.89

129

加蒸馏水定容至2000ml

7.

实验方法

7.1总RNA提取:

-lO.

温州医学院硕士学位论文 前列腺组织100mg

从㈨
如 入

-一一





M 刎 v瓤
ci



4℃



脯¨ 瓠

,一一



小心吸取上层水相转移至新的1.5ml离心管中


加入等体积异丙醇(O.5m1),颠倒混匀静置15min


再次4℃低温离心12000rpm,lOmm 加入75%乙醇

v川

洗 涤沉淀





离心彻底去除乙醇,

●上得

不士 ■●■J

心A 沉 淀

晾 干 备用

7.2逆转录反应合成eDNA:
采用TAKARA的RevertAid
ru

First Strand cDNA Synthesis

Kit,eDNA合成为

20pl的逆转录体系。简要操作如下所述:

温州医学院硕士学位论文

标本中提取总RNA21ag

加入Oligol8引物(O.5pg/m1)l

lal

1Jr
用DEPC处理水补至12山


混匀,离心3-5秒

● ● ●◆
37"(2温育5min置冰盒上

1lr

加地妣广4山
加入RNAase inhibitor(20U/ILd)I
gl

加入

●l



心 口 N

l删l
. ◆M. ◆
混匀,离心3.5秒
y ℃温育 7

I具 影啪 上 .宣 氲

加 入 M M儿 Ⅳ 毯
.-.

.精 录 酶配 ∞
n垡,

叫m

温州医学院硕士学位论文



1lr
7.3

普通RT-PCR反应

7.3.1引物设计设计引物时依据GeneBank里收录的Srd5al,Srd5a2的全序列,
引物通过primer 5.0软件设计,扩增区域Srd5al跨越exon4及exon5区,Srd5a2

则跨越咖n2/3及exon3区,具体见表1。
表1 引物序列如下

7.3.2逆转录合成的eDNA按40Ill反应体系行PCR扩增,具体见下表2

表2
组分 模板
10x Bufier

409mCR扩增体系 加入量
49l 49l

终浓度

1倍
150m讧

上游特异引物 下游特异引物 dNTP(1 0mM) TaqDNA多聚酶
ddH20

O.3山
0.3pl

150r】M 0.2mM 1.5ff管

o.8山
0.39l 27.1p1

.13.

温州医学院硕士学位论文 MgCl2(25mM)
Total 3.21al 409l

2.0mM

7.3.3普通RT-PCR反应按下述热循环参数运行: Srd5al基因:
94℃ 3min 15s

94℃ 92℃

6。s 60*(2

1 J


4。个循环

Srd5a2基因。
94℃ 94℃
92*(2 3min 15s

6。℃

608,45个循环

7.3.4普通RT-PCR产物鉴定,琼脂糖凝胶电泳分析 7.3.4.1*海河茫裕粒诺缬疽号渲剖室伺ǘ鹊那碇悄海诤张ǘ任希担保幔纾恚

的EB),在微波炉内加热溶解。待凝胶完全凝胶冷至60℃时,将凝胶液倒入放有 梳子的托架胶板上,使凝胶厚度为3-5mm。凝胶完全凝固后,撕掉两端胶带, 将托架放于电槽中,加样孔靠*负极端。加入电泳缓冲液,使之超过胶面约2mm,
拨出梳子(避免左右、前后摇动)。 7.3.4.2加样:在微量加样板上将PCR反应液与载样缓冲液(含0.25%溴酚蓝和

40%(W/V)蔗糖)5:1混合,用微量加样器将混合物加入凝胶样品孑L中。同时将
DNA Maker加入样品孔中。

5.4.4.3电泳:盖上电泳槽,接通电源,以5V/cm左右的电压进行电泳。一般溴 酚蓝

前移2-4cm时,即可停止电泳。 7.3.4.4紫外光检测:电泳结束后,将凝胶放于紫外光检测器的石英玻璃上,观 察各泳道是否有橙红色的荧光带出现,并同时电泳的100bp DNAMaker条带相 比较,以确定PCR产物的大小。
7.4荧光定量PCR反应 7.4.1引物及探针的设计

温州医学院硕士学位论文 设计引物时依据GeneBank里收录的Srd5al,Srd5a2的全序列,引物和探针通过
primer

5.0软件设计,扩增区域Srd5al跨越exon4及exon5区,Srd5a2则跨越

exon2/3及exon3区,引物及探针序列由上海生物工程有限公司。具体见下表3:
表3 PCR中所用引物和探针序列

注:LengthCop)指扩增产物长度;FAM指探针序列

7.4.2实时荧光定量PCR反应体系按409l扩增体系进行,具体见表4
表4 409lPCR扩增体系

将上述反应混合物加入到反应管中,加盖后置离心机以2000r/min离心30s,将
反应管放入反应架中。 7.4.3实时荧光定量PCR反应参数: GAPDH基因:

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94℃ 94℃
92*(2 60s 3min 15s



}30个循环

60。C


3min 15s

Srd5al基因:
94℃ 94℃ 92*(2
60s 60"(2

1 j
3min 15s

}40个循环

Srd5a2基因:
94℃ 94℃
92。C 60s



60"C



}40个循环

以上反应在SLAN全自动荧光定量PCR仪进行。 8.免疫组化操作流程 8.1载玻片防脱片剂处理:可选择Poly-Lysine。捞片后置烤箱58-60*C,30450 分钟以使切片紧密粘附。 8.2切片常规脱蜡至水。
8.3

30%H202

1份+蒸馏水10份混合,室温5.10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水

洗3次。

8.4热修复抗原:将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH6.O),电炉或微波炉加
热至沸腾后断电,间隔5.10分钟后,反复1.2次。用冷却后PBS(pH7.2.7.6) 洗涤1.2次。 8.5滴加5%BSA封闭液,室温20分钟后,甩去多余液体,不洗。

8.6适当稀释的一抗(山羊I的或大鼠),4*C过夜。PBS(pH7.2—7.6)洗2分
钟×3次。(一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系. 一般来说,阳性染色强度不够时,可提高一抗浓度和延长孵育时间;背景 过高时,可降低一抗浓度和缩短孵育时间。) 8.7加生物素化兔抗山羊IgG(或兔抗大鼠IgG)(SP法使用HRP标记兔抗山羊
igG),20-37。C

20分钟。PBS(PH7.2.7.6)洗2分钟×3次。

8.8滴加试剂SABC,20-37℃放置20分钟。PBSff,rt7.2.7.6)洗5分钟×4次.(SP

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法则省去此步骤)
8.9

DAB显色:使用DAB显色试剂盒。取lml蒸馏水,加试剂盒中A、B、C 试剂各1滴,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间,一般在5-30
分钟之间。也可自配显色剂显色。蒸馏水洗涤。

8.10苏木素轻度复染。脱水、透明、封片。显微镜观察。
9.

结果判断及分析

9.1实时荧光定量PCR结果分析:PSA mRNA与GAPDH mRNA扩增反应结束 后调节基线至适宜处,各荧光曲线与基线交叉点的循环数即为循环阈值
(Cycle threshold,c0,并调节域值范围,判断结果。用相对定量的方法对实验 结果进行分析,Srd5a/GAPDH mRNA用ACt进行统计学分析,ACt=Ctsfd5r
CtGAPDH。

9.2免疫组化结果判定及分析:利用Image.Pro IOD值对黄色阳性区域进行相对定量分析。
10.统计学处理

Plus

6.0图像分析软件对有目的蛋

白高度表达的部位所呈现的黄色区域进行扫描,分析软件将根据所得到的

采用SPSSll.5统计软件分析,所有计量数据以均数±标准差形式表示,并 进行正态性检验。多组样本均数比较进行方差齐性检验,组间比较采用单因 素方差分析(one.way ANOVA),当尺O.05表示有显著性统计学差异。

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结果
1 1

标本总RNA提取及逆转录的质量鉴定
1标本中提取总KNA的鉴定 用紫外分光光度法检测,A260/A280在l 结果见附录2。
8—2

0之间,说明无蛋白质的污染

甲醛变性琼脂糖凝胶电泳如图1。

注:经 的污染 倍,说

2、普通

注:如图所指示的条带位r 100bp L打,符合Srd5al基陶的片段长度124bp 所处位置,可以判断该扩增产物为目的产物Srd5al基H。

圈2

Srd5al基陶PCR产物电泳图

温州医学院硕士学位论立

注:如图所指小帕条带I奇』100bp F打,符台Srd5ct2基降IffJ片段蚝度93bp 所处位置,可以削断该扩增产物为日的产物SrdSct2基l州.但注意与图中娃示 的0『物一聚体k别。

■3

SrdSrt.2基I,q PCR产物电泳圉

2、实时荧光定量PCR扩增反应实验结果。 药物处理后,采川实时荧光定量PCR榆测各实验组前列腺组织中1型5廿还原酶 mRNA和2型5n.还原酶rnRNA的表达,各实验组与空白对照组相比较,1型5d. 还原酶mRNA和2型5Ⅱ.还原酶mRNA的表选量的ACt值的差异尤统计学意义
(F>0

05)。具体数捌见F表5驶附录,荧光定量PCR产物扩增lflI线见附图1。 表5并组问Srd5 ctlmRNA和Srd50.2 TrLRNA的表达比较 组别付目标
A组

srd5“l(x-+SD)

srd5“2(。±sD)

』∑Ct(CtsⅢ5。l-ck…)
1I 49±1 48‘ 11 02±I 78‘ 11 05土2 26A 1I 21±1.75
05:

ACt:Cts咖?CtGAPD¨)
6 32:L0 84‘

B组 C组 D组
£:与D组比较:Af>0

6 57:L0 33‘
7 44:--1 92‘ 6 82a:0 45

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■4

Srd5almRNA和StdS02mRNA在备组之间的表达比较

附■l:荧光定量PCR』“物扩增曲线图

■s参照基州GAPDH荧光扩增产物曲线

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l_『| | 0_{_。。』笙。
■6目的基闻SrdSal荧光扩增产物曲线 ■7目的基因Srd5a2荧光扩增产物曲线

3、各组间老龄大鼠前列腺组织中MVD值和eN0s蛋白表达量的变化情况。

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免疫姐化检测结果显示:各治疗组均与正常对照组比较均有统计学差骨

(只0 05),A组MVD值明显高于B组(J吣0 05).A组MVD值与C组之间统 计学术见明显差异(卢01),A、B、C组eNOS蛋白表达量也明显低于D组 fP<0 051.但A组明显低于B与C组(只o 05),具体数据见表6.各检测指标
的蛋白表达图片见附图2。

表6爱普列特对前列腺组织中MVD和eNOS的影响

洼与D组比较:?P<005:与A坌[1比较6

P<0 05

■8并组之间MVD值和eNOS蛋向表达的比较

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■A爱普列特.^=剂量组eNOS蛋白表达

■矗爱普列特小荆景组eNOS蛋白表选

(xⅧ倍’

IX4∞衡



I,:





:’?’:.
正常组eNOS蛋白表选

图C保列治组eNOS蛋白表达

■D

(’c400鲁’ 附■2再纽之问eNos蛋白的比较 4、老龄大鼠前列腺组织中Bcl-2.Bax蛋白的表达情况。

(×400舢

免疫组化sP法检测Bcl-2,Bax蛋白的表达发现:A、B、C组bax蛋白高于正常

对照组,差异具有统计学意义(只O 05)。各治疗组之问Bax表达差异尤统计学
意义(f>0 05】。三组用药大鼠Bcl-2表达明显低于正常对照组,差异有统计学

意义(只o 05)。用药各组问,差异无统计学意义(/b0

051。

A、B、C三组

用药大鼠Bax/Bc',-2表达明显高于正常对照组,差异有统计学意义(/%0 05)。用

药各组问,差异无统计学意义(f>0 05)。具体数据见下表7,各检测指标蛋白
表达图片见附图3、4,

塞!墨竖丕垦盟!!壁望堡!墨塑旦望!丝:堡坚塞垄!!璧 望&业塑篮
A组

里坠坐Q望堕:三圭!婴呈生型旦旦堕:三圭!垡
390±167" 148±42‘

墅型璺生型三圭!旦!
2 93±I 63*

温州医学院硕士学位论文 B组 C组 D组
注与D组比较:’P<005 358±156* 3ll±155* 185±73 17l±66+ 152±59+ 216±52 2.23±0 94* 245±211+
0 95±0 55

■9老龄大鼠前列腺组织中异组间Bcl-2,Bax蛋白表达比较

綮嘲£1
■^爱普列特大剂最组13ax蛋白表达

&瀑 擎然

(×4∞伽

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萨褥
■c保列淆组Bax蛋n表达 ■D

恤弭¨v





,夕转、 ‘≮o
lE常自l Bax蛋白表达

ix,mooQP)
膏■3

(X400倍'
再目12问hax蛋白表达的比较

lillA爱斡列特大剂营组Bcl-2蛋门表达
(×400蕾’



啜.

漂. 滚
()c蜘

■B爱普列特小剂景纽Bc】一2蛋白表达

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■c保列清组Be92蛋白表达

■D正常组Bc}2蛋白表达

供400●'

(×4柏鲁) 膏■4弄组之问Bcl-2蛋白表达的比较

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分析与讨论
1.爱普列特度对前列腺组织中5 Q还原酶帐NA的影响

5叶还原酶在体内分布比较广泛,据报道【-2】鼠的非雌性目标组织和卵巢中的 主要表达2型5a-还原酶mRNA,而在肝脏中只表达l型5a-还原酶,且雌性鼠肝脏 中的1型5a-还原酶活性比雄性高10-20倍,2型5a-还原酶mRNA主要分布于生殖
组织,如睾丸、输精管的器官。有研究发现【131正常前列腺的间质细胞和基底上

皮细胞,精囊的间质细胞,附睾的上皮细胞产生2型5a.还原酶,而增生的前列腺
和前列腺肿瘤仅由间质细胞合成2型5a-还原酶。而在人的大脑中也有5a.还原酶 的分布,S矗nchez P等‘143研究发现,新生雄性和雌性大鼠在给予睾酮作用后, 检测1型5a-还原酶和2型5a-还原酶的mRNA的表达,发现睾酮在新生大鼠中调节 1型和2型5a-还原酶mRNA的机制是完全相反的,睾酮作用后,新生大鼠脑组织 中的2型5a-还原酶mRNA水*上调,而l型5a-还原酶mRNA水*下调,说明睾 酮可以对1型和2型5a-还原酶的调节作用是相反的。而S矗nchez
P[15 3该课题组在

用sulpiride处理成年大鼠时发现,1型和2型5洳还原酶的mRNA的表达都上调, 说明压力等心里因素也可能参与5a-还原酶在大脑中的表达的调节。 5a-还原酶在前列腺组织中的作用是人们极度关注的,前列腺是一个管道腺 泡结构的腺体,它的生长发育从胚胎时开始到性成熟后完成。人体前列腺的发育 是自尿生殖窦上出现前列腺芽开始,起源于10周的人胚内胚层,在小鼠开始 于胚胎17d,而大鼠则在胚胎的19d开始。尿道的球状腺体、前列腺和尿道膜部

都源于尿生殖窦。正常前列腺细胞的发育生长是在多种基因和激素的相互作用下 完成f16J,其中双氢睾酮DHT在前列腺的生长发育中起着重要作用。对兔、大 鼠和人胚的研究发现,5甜还原酶存在于前列腺和外生殖器分化之前的尿生殖窦
和外生殖器原基中。但是,在附睾、输精管和精囊分化时,5a还原酶并不存在于

中肾管组织中。因此,睾酮和它的5a-还原产物DHT发在胚胎时期对男性性别 发育具有特异性的作用。后来有研究者应用特异性5a-还原酶抑制剂和基因敲除 实验进一步证实DHT在前列腺生长发育中起作用。给予大白鼠和猴特异性5a-
还原酶抑制剂fimsteride,能阻碍其雄性动物的性别分化并阻碍前列腺的生长发

育【17】。敲除小鼠的5a-还原酶或5伍.还原酶抑制剂抑制5a-还原酶基因会导致其 前列腺变小。这说明5a-还原酶在前列腺的发育中也发挥着极其重要的作用。
以往认为2型5a-还原酶发生作用在BPH的发病机理中起主要作用,而1型5a

还原酶所产生作用81曼d,vsJ。但是最*的研究表明,使用2型5Q.还原酶抑制剂治 疗后*中DHT水*下降70%,前列腺组织中DHT下降85--90%[19?201。剩余
的DHT来源于l型5a-还原酶的作用。由前列腺外的组织中l型5a-还原酶产生的

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DHT可以经血循环进入前列腺组织,或由前列腺组织内可能存在的2型5ct-还原 酶作用产生。这两种途径产生DHT均可影响前列腺的生长。最*的研究已证实, 前列腺组织存在1型5ct-还原酶mRNA,蛋白质和酶活性…21。前列腺内的1型5q.
还原酶也参与前列腺内DHT的产生。所以,1型5a-还原酶也可能在BPH的发 病机制中起一定作用。Ye LF等‘221也研究报道,人BPH组织中2型5a-还原酶 mRNA高于正常前列腺组织,BPH组织中体积较大组织的也比体积小的表达高。 而l型5ct-还原酶mRNA在人正常组织中的表达与BPH相比没有差异,而BPH 组织中l型5ct-还原酶表达不随组织体积大小而变化,所以l型5ix-还原酶在前列腺

组织的作用依然需要更进一步的研究。 基于5ct-还原酶的在前列腺组织中的特殊地位,本实验通过爱普列特对的前 列腺增生老龄大鼠的进行药物处理,短期d,3*U量灌服后,利用探针法荧光实时定 量PCR对组织中1型和2型5a.还原酶mRNA进行定量检测,检测结果显示:爱
普列特大剂量组、保列治组与正常对照组进行比较时,结果无统计学意义,所以 考虑5a-还原酶抑制剂(爱普列特)只能通过抑¥IJsa-还原酶的活性以减少睾酮向

双氢睾酮的转化,减少前列腺组织双氢睾酮的含量,来进一步促进前列腺细胞凋
亡,减小前列腺体积。但是由于上游的2种5a-还原酶mRNA仍可以不断的产生, 患者停用5ct-还原酶抑制剂一段时间后,新产生的50r-还原酶mRNA可翻译成5cz- 还原酶,促进睾酮向双氢睾酮转化,最终导致前列腺的继续增生。这可能是前列 腺增生药物患者需要长期用药的原因之一。

由于本研究标本量较少,时间较短,实验方法单一,所以实验结果的准确性, 需要增大标本量、延长药物作用时间等实验方案的调整进一步研究证实。爱普列
特在临床上用于治疗前列腺增生症时效果较好,深入研究它对前列腺组织中5口 还原酶基因的作用机制,有较好的临床意义,可为爱普列特治疗前列腺增生症提

供充分的理论基础。
2.爱普列特对前列腺组织中eNOS蛋白和微血管密度的影响

前列腺增生症主要是间质增生引起的,这些间质增生依靠雄性激素依赖而产 生,而通常的一种学说认为:新生血管的生成在前列腺增生中发挥着至关重要的 重要,如果缺乏新生血管血供的支持,任何实体的增生都难以生长。Junkson等c231 就在前列腺增生组织中发现许多与血管密切关系的生长因子的表达都会增高。 而CD34在正常及肿瘤性的小血管内皮细胞中都有表达,是一种与新生小血 管相关的抗原,其临床应用前景十分广阔,尤其用于作为血管内皮标记物。


于CD34在血管内皮系统中的作用机制目前尚不完全了解,由于其在新生血管内 皮中表达远大于非新生血管内皮,提示其作用可能与血管生成有关。刘孝东等‘24】

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在对于非那雄胺的研究中以CD34为血管内皮计数标记物,发现竞争型5a-还原酶 抑制可以抑制血管的生成,但并未对非竞争型5a.还原酶抑制对前列腺增生组织 血管变化的研究,本实验通过以非雄胺为对照组,对非竞争型5m还原酶抑制爱 普列特进行研究发现:A组和B组微血管密度分别为:4.35±2.20,
6.25±1.29,

而空白组D组微血管密度最大:8.00±2.98,而C组的作用效果与A、B组作用相 似,也可以初步证明非竞争性5a-还原酶抑制剂可以抑制大鼠前列腺血管生成。 一氧化氮(NO)是一种重要的调节生命活动的活性分子,是L厂精氨酸在一氧

化氮合酶(NOS)的作用下产生的,NO产生后可先与一种含.SH的载体分子结
合,到达靶细胞后从载体释放并透过细胞膜进入靶细胞,与一些酶或Fe2+结合,

激活鸟苷酸环化酶(GC),增加细胞内的环状单磷酸鸟苷(cG砌)的含量,产生一
系列生物学效应,如扩张血管、调节血管张力、抑制血小板聚集及调节细胞有丝 分裂的作用‘25】。Zk:he等‘26 3首次证明NO在体内能介导毛细血管的发生,在体外

能通过P物质促进内皮细胞生长和迁移。Papapetropoulos等‘27 3证实,在体)}.NOS
抑制剂能削弱转化生长因子B1刺激的毛细血管形成,提示NO能诱导毛细血管发

生。Babaci等嗡1用牛肺动脉内皮细胞和转染内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的*滑
肌细胞共培养,产生了跟转染血管内皮细胞生长因子类似的结果,即eNOS过度

表达能诱导新生血管的发生。内皮型一氧化氮酶(eNOS)主要在内皮血管表达,
具有血管扩张和促进血管生长的作用【29l。

在前列腺组织中,eNOS主要表达于前列腺上皮和血管内皮细胞。Gradini等【301
的研究显示,正常和增生的前列腺组织中均有eNOS的表达。而本实验通过爱普

列特治疗老年SD大鼠,在研究中发现,爱普列特大剂量eNOS蛋白表达量,较小 剂量明显减少,说明爱普列特可以下调前列腺组织中eNOS蛋白的表达,进一步
抑制前列腺组织中血管生长,并且其作用呈剂量依赖性。爱普列特大剂量组与保

列治比较,发现爱普列特对eNOS蛋白表达抑制作用稍强,但还需要进一步研究 证实。鉴于本实验结果,可以考虑爱普列特作用于5伍.还原酶,使睾酮转化双氢 睾酮过程受到抑制,体内双氢睾酮量减少,可能使体内一些酶活性降低,鸟苷酸 环化酶失活,使体内eNOS活性降低,新生血管生长受到抑制。而且发现爱普列 特对血管生长抑制作用与保列治相差不大,均有明显抑制作用。 综上所述,通过本实验可以初步证实爱普列特对前列腺增生组织微血管相关 蛋白及微血管密度都有明显抑制作用,而临床上使用爱普列特能有效减少TURP 术中出血和有效缓解临床患者血尿症状,其机制可能与抑制了前列腺组织中的血 管生成等相关,其抑制作用与保列治大致相似,但在具体作用机制上还需要进一 步研究。
3.爱普列特对前列腺组织中凋亡蛋白Bax,Bcl-2的影响

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良性前列腺增生(BPH)的发病机理迄今尚未完全阐明,细胞凋亡在其中的作
用己受到人们的重视。青春期后男性前列腺已发育至正常大小,在正常雄激素水 *下,前列腺组织中细胞增殖与凋亡的比率均维持在1%~2%,并保持*衡。随

着男性进入老年期,体内各种激素水*及其他因素发生了变化,致使前列腺细胞 增殖活性升高而细胞凋亡水*下降,最终前列腺组织因过度增生而导致BPH的
发生。因此BPH发生过程中细胞凋亡与细胞增殖起同样关键的作用。 细胞凋亡是*年来生物学及医学研究的一个热点。凋亡不仅是一种特殊的细

胞死亡类型,它还具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。对凋亡的 研究有助于对疾病过程中细胞死亡及其机制的深入阐明,细胞凋亡受多基因调
节,目前比较关注的细胞凋亡与前列腺增生的学说有以下几种:(1)雄激素与前

列腺细胞凋亡之间的关系;(2)细胞生长因子与前列腺细胞凋亡之间的关系;(3) 凋亡相关基因与前列腺细胞凋亡之间的关系,其中包括多种癌基因和抑癌基因
如:c-myc、Bcl-2、p53、fas等,其中Bcl-2是与细胞凋亡关系最密切。

Bcl家族是目前备受关注的与细胞凋亡关系密切的基因之一,它是一个大 家族,有多个家族成员,如Bcl.2,Bax,Bal-xI.Bad等‘3”。其中Bcl.2及Bc
l-XT

主要抑制细胞凋亡‘32】,而Bax则促进凋亡‘331。Bcl-2家族成员中可发生相互作 用即彼此之间的同源或异源聚合共同调节细胞凋亡‘341。其中Bd-2/Bax的比例 可决定细胞的命运,其比例增高,细胞不易发生凋亡,而比例降低则导致细胞凋 亡。有关Bcl-2阻碍细胞凋亡的确切机制最*观点为‘351:Bax诱导细胞色素C

的释放,激活Caspase-3(Caspase-3是含有半胱氨酸天冬氨酸特异的蛋白酶.3),
引起膜泡形成,核碎裂和细胞死亡。而Bcl-2可能与凋亡促进基因Bax拮抗, 抑制细胞色素C自线粒体释放至胞质,阻止胞质细胞色素C对Caspase蛋白酶

的激活。Bcl-2还能促进谷胱甘肽进入细胞核,从而改变核内氧化还原反应,阻 止Caspase蛋白酶的激活和其他核改变,抑制细胞凋亡。Bcl.2是B细胞淋巴瘤
/白血病-2(B
Caenorhabditis cell

lymphoma/Leukemia-2,Bcl-2)基因的缩写形式。它是线虫

elegans生存基因Ced.9的同源基因[3副。Bcl-2表达蛋白位于核膜,

一部分存在于内质网和线粒体外膜。通过转基因动物和转染实验发现,Bcl-2基 因对于细胞凋亡具有明显的抑制作用【37】。Bcl.2通过阻断凋亡信号的最后通路而

抑制凋亡,从而使细胞存活。研究表明,Bcl-2的过表达可部分的抑制由APO. IlFAS系统介导的凋亡[圳。 目前研究发现Bcl-2参与了前列腺增生的发生和发展。Bcl-2的过度表达, 导致腺体细胞的凋亡受到抑制,细胞的增殖与死亡失去*衡,使细胞堆积。谢庆 祥‘393等研究显示Bcl-2和Bax在BPH的上皮增生过程中起着重要的作用,而且 两者之间的比例对上皮细胞凋亡的敏感性有着重要的影响,其中Bax减少对上

温州医学院硕士学位论文 皮细胞增生的作用可能较Bcl.2增多的作用更为显著。 本研究显示在应用爱普列特以后可以明显降低Bcl.2的表达,提高Bax的表 达,并且可能存在剂量依赖性。而且从具体均值数据来看,相同用药剂量比较, 爱普列特提高Bax表达的能力较保列治更强,这可能和其起效较快的临床特点 有一定关系。但两组数据统计学差异无显著性,可能是实验样本量较小关系。所 以此推测还需要进一步更大样本的深入研究证实。同时本研究还发现2种药物都 可以非常明显的降低Bcl.2的表达,提高Bax/Bcl-2比值,这可能和他们相类似 的作用机制有关。而从本实验中各组IOD均值数据的分布趋势(见图9)和免疫 组化图片(附图3、4)又可以初步看出Bax蛋白差异表达比Bcl.2变化稍微明显,

这与谢庆祥口引报道的Bax在前列腺上皮细胞的凋亡促进作用比Bcl.2的凋亡抑
制作用更将明显基本符合。 依据本实验结果考虑,爱普列特可以显著增强老龄大鼠前列腺组织中凋亡促 进因子Bax表达,减少凋亡抑制因子Bcl-2表达,可能是通过激活Caspase蛋白 酶通道和其它核的改变,促进前列腺增生组织细胞凋亡的发生。但是凋亡的增殖 与抑制与多因素相关,其作用机制还需要深入研究,进而为爱普列特治疗前列腺 增生的临床应用提供理论参考。

小结
爱普列特作为一种新上市的5a.还原酶抑制剂,由于其药效与保列治相似, 且作用效果较快,已经迅速应用于临床,而且其临床实验研究均已得出相应的结 果,显示出他的药理效能较好。我们通过本实验得出以下几点结论: 1.基本证实短期小剂量服用爱普列特不能抑制5a.还原酶mRNA表达,但本 实验研究较少,其对基因水*方面的作用需要进一步的研究。 2.爱普列特可以通过对微血管的抑制作用治疗前列腺增生,这与临床上采用 爱普列特治疗前列腺增生症血尿症状和有效预防TURP术中过多出血时的作用 基本相符合。

3.爱普列特治疗前列腺增生时,对凋亡蛋白Bax,Bcl.2都有明显的作用,但
是由于细胞凋亡的作用机制比较复杂,是由多因素决定,所以爱普列特对凋亡蛋

白的作用还需要进一步研究。
因为本实验为了探讨体外模拟小剂量服用爱普列特的作用机制,实验剂量较 小,所以并未对其毒效性和安全性的进行研究。而长期服用爱普列特或者说超剂 量服用时对SD老龄大鼠50【一还原酶mRNA的表达影响需要进一步的研究,该药物 的长期服用50【.还原酶的相关的分子调节机制依然是我们继续值得关注的课题,

因为它对于我们研究BPH的靶向基因治疗有相当大的帮助。

温州医学院硕士学位论文

参考文献 【1】.吴阶*:吴阶*泌尿外科学,山东,山东科学技术出舨社,2004:1127. 【2】顾方六,孔祥田,杨勇等.良性前列腺增生.中华泌尿外科杂志, 【3】.MeConnell lVID:Etiology,Epidemiology,pathophysiology,and
prostatic hyperplasia Campbell’S Urology,2003,1297—1336. 1999,20:225. natural history of benign

【4】.Metcalf BW,Holt
5a-reductase by

DA,Levy MR,et at Communication:potent inhibition of human steroid

3一androstcne.3-伽rl埘可lic..Bio Cbem,1989,17372-376.
MA,Levy,Oh H et at Inhibition ofsteroid

【5】Holt DR,Levy

5-却ha

reduetase by unsaturated 3?

carboxysteriods.Med Chem,1990,33943—950.

【6】.Steers WD,Wilson

JD,Geroge脚t a1.5-alpha

rcductase

activiIy

in

the prostate.Urology,

2001,58(supple6A):17—24. 【7】.薛兆英,韩文科,金杰等.爱普列特治疗良性前列腺增生Ⅱ期临床研究.中国临床药理 杂志,2000,16:432.435. 【8】.李宁枕,那彦群,丁强等.新型5a还原酶抑制剂爱普列特治疗良性前列腺增生的Ⅳ期临 床研究.中华泌尿外科学杂志,2002,23:413.416. 【9】.Sun
Toxicol ZY,Feng

J,Qi XD,et at

Reversible long-term

toxic毋of

epristeride in beagle dogs.

Appl Pharmal,1999,154:145-152.

【lo】.李家泰,郑直,金杰等.爱普列特正常人体耐受性研究。中国临床药理学杂志,2000,
16;419-423.

【1l】.5a还原酶抑制剂治疗对前列腺增生患者血清性激素水*的影响.Chinese
Andrology.2007,3:16-19.

Journal of

【1 2].KNorm ington,DW

Russell

Tissue distribution and kinetic characteristics

of rat steroid 5 1992;

由ha-reduetase

isozymes.EvHence for distinct physiological

functions.Bi01.Chem.,Sep

267:19548.19554.

【13】.张元芳,叶烈夫,丁强,等.前列腺组织中2型5a.j丕原酶表达的研究.中华泌尿外科杂 志,2001,3:10.15


【14].Shnchez P,TorrcsJM,Dcl Moral RG,et_al
steroid

Effects oftestosteroneon brain mRNAlevels of



5却ha-reductase isozymes in early postnatal l如ofrat.Neuroehem Int,2006,49:626-30.

【151.S缸chezP,TorrcsJM,DelMoralRGet.at EffectsofsulpirideonprolaetinandmRNAlevels
ofsteroid

5却ha-reductase isozymes

in adult r缸brain.Neuroehem

Res,200833(5):820-5.

【161.Marker

PC,Donjacour从Dahiya R,et at Hormonal,cellular,and molecular control of

prostatic devebpment.Dev 8i01,2003,253:165?174.

.32-

温州医学院硕士学位论文
【171.Imperato-McGinley oftbe

J,Sanchez RS,Spencer JR,et a1.Comparison of the effects
011

5a-reduetase inhibitor fmasteride and the antiandrogen flutamide

prostate and genital

differentiation:Dose-response studies。Endocrinol,1992,13 1:1 149—1 156。

【1 8】Steers WD,Wilson JD,Geroge
2001,58:17-24.

FⅥr,et a1.5-alpha reductase activity in the prostate.Urology,

【19】Mcconell JD,Wilson

JD,Geroge吼et a1.Finasteride,a inhibitor of 5?alpha reductase,

surppresses prostatic dihydrotestosterone in men、加tlI benign prostatic hyperplasia.Clin

Endroerinol Metab,1992,74:505-508.

【201 Norman

RW,Coakes KE,Wright

AS,et a1.Metabolism in men receving finasteride before

prostateetomy.Urol,1993,150:1736—1739.

【21】Sartsch G

Rittmaster RS,Klocker.Dihydrotestosterone and the concept of 5-alpha reductase

inhibition in human

benign prostatic hyperplasia.World

J Uml,2002,19:413-425.

【22】Ye LF,Zhang
isoenzymes in

YF,Fang ZJ.et a1.Expression and significance of steroid 5alpha-reductase hyperplastic prostate tissues.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2003,83:1296—1299.

benign

【23】Allen
and

NE,Forrest

MS,l(ey

TJ,et a1.The association between polymorphisms in the CYP1 7 serum

5alpha-reductase(SRD5a2)genes and

androgen concentrations

in

men.Cancer

Epidemiol biomakerP形v’2001,10:185-189.

【24】Berthaut I,Mestayer C,Portois MC,et
expression of the two

a1.Pharmacological and molecular evidence for the in normal

steroid 5alpha-reductase isozymes

and

hyperplastic

human

prostatic eeHs in culture.Prostate,1997,32:155-163.

【25]Andriole GL,Kirby

IL Safety

and tolerability of the dual

5alpha-reductase inhibitor

dutasteride in the treatment of benign prostatic hyperplasia.Eur Urol,2003,44:82-88.

【26]Akaza H,TsukamotoS,Morita T.Promoting effects
prostate carcinogenesis induced by Prostatic Dis,2000,3:115—119.

of Anti-androgenic agents

on

rat

ventral

3,2-dimethyl一4一aminobiphenyl(DMAB).Prostate Cancer

【271

Papapetropoulos A,Desai

KM,Rudic RD,et stimulated

al,Nitric oxide synthase inhibitors attenuate

transforming

growth factor beta l

cap illary organization in

vitro【J】.Am

J Pathol,

1997,150:1835-1 844.

【28】Babaei S,Stewart DJ.Overexp ression of endothelial NO synthase induces
angiogenesis in


c02culture

model【J】.Cardiovasc

Res,2002,55:190—200.
of

【29]Wu Shu—Fang,Sun Hong-Zhi,Tu Zeng—Hong,et a1.Effect TGF?D

epristeride on

expression of

receptor in rat prostatic epithelial cells in vitro.Acta Pharmaeol Sin,2001,22:516-520.

[301 Sun HZ,Wu receptors

SF,QiⅫ,et a1.Effect ofepristeride

on

the expression of IGF—l and

TGF-B

in androgen-induced easwated rat prostate.Exp Biol

Med(maywood),2001 226:9?960.

.33.

温州医学院硕士学位论文
【3 1】McDonnell
T J,Beham

A Sarkiss M,et at Impotance of

the Bcl-2

fam毋in

cell death

regulation.F.xperientia,1996,52:1008 【32】Boise
a.q





Gonzale



Garcia M,Postema C E,d at Bcl-x,a bcl-2一related gene that functions

adominant regulator of apoptotiz cell

death.Cell,1993,74:597
Bax suppresses oftumor igenesis and stimulares

【33】Y'm C,Knudoson C M,Korsmeyer S J,ct at
apoptosis irI vivo.Nature,1997,385:637

【34】Yang互Zha J,Jockel

J,et at Bad,a heterodimeric parthen for Bcl-xL and Bcl-2,displaces Bax

and promotes cell death.Cdl’1995,80"285

【35】明学志,细胞凋亡调控及其进展.国外医学,肿瘤分册,1998,25:321

【36]I-妇allll Steiler.Mechanisms and

genes ofcellular suicide.Science,1995,267:1445 1994,16:148 1997,

【371张晓东,细胞凋亡相关基因研究进展.国外医学,分子生物学分册,

【38】成军,程序化细胞死亡与疾病.北京医科大学与中国协和医科大学,联合出版社,
2.5

【39】谢庆祥,汪鸿,缪友仁等.细胞凋亡相关基因bcl-2和bax在前列腺增生组织中表达的
意义.中华泌尿外科杂志,
1998,19:98.100

.34—

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附录1 缩略词表

温州医学院硕士学位论文

附录2
前列腺组织标本RNA提取物的紫外光吸光度测量值

.36.

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.37.-

温州医学院硕士学位论文

.38-

温州医学院硕士学位论文

.39.

温州医学院硕士学位论文

.40—

温州医学院硕士学位论文

.41.

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M 他 ∞

15.3 15.67 17.57 16.74 15.77 18.22 17 17.41 16.53 16.68 18.18 15.68 18.25 16.65 17.56 15.36 15.59 16.84 15.13 18.71 15.66 16.12 15.4 18.36 15.48 16.04

28.33 27.84 28.19 29.89 27.52 26.25 28.15 28.53 27.09 27.29 28.57 28.25 27.48 28.57 29.17 26.3 30.17 27.8l 27.21 32.03 26.12 27.43 27.18 27.04 28.57 26.34

21.95 22.9l 23.57 23.17 21.69 25.12 23.65 24.05 23.05 23.28 25.15 21.39 24.85 23.26 23.92 21.69 22.29 22.66 21.8l NTC 23.06 22.4 21.94 25.32 21.78 22.51




笳 觚 能 触







M 小 舶 加 心 肿 枷





Ⅸ Ⅸ 酯

.42.

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标本编号

GAPDH

Srd 50tl

Srd50t2

.43.

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..44.

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个人简历

姓名:吴伟 性别:男 出生年月:1981年5月 籍贯:湖北省通城县 教育程度及经历:

1997年9月一2000年6月 2000年9月一2005年6月 2005年7月一2006年7月
2006年9月一2009年7月
断学 论文发表情况:

湖北省通城县第一中学 湖北省咸宁学院临床医学专业 湖北省通城县中医院 温州医学院硕士研究生 内科住院医生 临床检验诊

1.爱普列特对老年大鼠前列腺组织中微血管的影响。浙江医学已收录;吴 伟、蔡冰、陶志华,2009.3登刊 2.爱普列特对老年大鼠前列腺组织中bcl-2,bax影响。 冰、吴伟等,待发表 3.持续小剂量tadalafil对SHR阴茎海绵体组织形态及血浆ET-1影响。中 华医学杂志;武志刚、翁志梁、吴伟等,待发表 4.持续小剂量口服他达拉非治疗ED的疗效观察。 武志刚、翁志梁、吴伟等,2008.12登刊 5.前列腺癌患者外周血PCA3 mRN^和PS^mRNA水*检测的临床意义。中华 检验医学杂志;林晓梅,许刚,吴伟等.已收录,2009年5月登刊。 中国男科学杂志已录用; 中国老年医学;蔡

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致谢 在此向曾经给我帮助和支持的人表示衷心的感谢。 首先感谢我的导师.陶志华教授,感谢检验科各位老师在学*、科研 及生活等各方面对我的指导与照顾。您渊博的专业知识、严谨的治学 态度、精益求精的工作态度和丰富的临床经验,永远是我学*的榜样。 感谢课题组陈占国、戴美杰、周武等老师在本课题设计及实施的每个 阶段给予的悉心指导与帮助。 感谢同学许刚,何晶晶,毛易捷,以及胡王强等各位师弟师妹在课题 实施过程中给予的宝贵建议与鼓励!! 感谢检验科全体老师在我实验和临床实*阶段给予的悉心指导和帮
助。

感谢茶山动物房及同德楼四楼实验室各位老师的帮助。 最后,感谢培养我长大含辛茹苦的父母和家人!!

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综述


a一还原酶抑制剂和前列腺增生
Prostatic

摘要:5a还原酶在良性前列腺增生(Benign

Hyperphsh,BPH)的发生与

发展中扮演重要角色,并成为良性前列腺增生治疗药物的关键作用靶点.寻找其 抑制剂也成为良性前列腺增生治疗药物研究开发的热点。本文概述了国内外对 5a-还原酶抑制剂的研究概况.为良性前列腺增生症的药物治疗与新药开发提供
参考。
BPH(Benign Prostatic

Hypcrphsb,BFH)是中老年男性的常见病和多发病,

它所引起的排尿梗阻症状给老年人的生活带来极大的影响。严重影响老年患者的 生活质量。国内外学者对前列腺增生的发病机制研究已历数十载.但确切病因目 前尚来完全阐明。*一个世纪以来,手术治疗BPH曾作为唯一有效的治疗方法, 虽然手术疗法的效果较好,随着手术方法的改进,死亡率明显降低.但是手术总 是对患肯,特别是老年患者造成不同程度的创伤和痛苦.而且有一定的并发症。 随着对BPH嫡因及发病机制研究的逐步深入,药物治疗得到r很大的发展,5n 还原酶抑制剂和nl受体阻滞剂得到r广泛的应用。药物治疗取代了手术治疗, 逐步成为BPH的一线疗法。雄激素是谢控前列腺生长的昂重要激素,BPH发生 的两个重要前提就是老年及具有正常功能的睾丸。老年人体内雄激素水*的变化
在BPH发病机*淼淖饔谜找嬉鹑嗣堑闹厥印G傲邢偈切奂に匾览敌云鞴伲

它的生长、发育、正常结构和功能的维持都有赖于睾丸提供足够的雄激素…。 Wilson的取氢睾酮学说Ⅲ作为良性前列腺增生症的发病机理已为人们所接受,根
据此理沦,寻找BPH治疗药物的过程中.5a-还原酶成为药物的作用靶点,其抑

制剂亦成为药物研发的热点。5a-还原酶在前列腺的发病机制中有着极其重要的 的作用。具体机制如图所示:

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1.5a-还原酶的研究概况
1.1

5a-还原酶的发现、命名和酶的特性Levy H R等人于1959年在细菌中发现

能催化甾体氧化还原的酶,并将其命名为3-oxo-5a-steroid:(acceptor)A4.oxido
reductaset31,其名称于1965年正式被国际,鼠酶学委员会采纳,编号为EC
99.5。Shimazaki 1.3. S

J等人于1965年从人的前列腺中分离出55还原酶14],Shefer

等人于1966在研究大鼠肝脏中5俚一胆甾烷.3 13.醇的合成时发现了胆甾烯酮 5a-还原酶,并将其命名为cholesterDne 5a.reduetaset5l,此名称于1972年正式被 国际酶学委员会采纳,编号为ECl.3.1.22。 甾体5a-还原酶的命名根据其底物的名称而定,有睾酮5a-还原酶(ECl.3.1.22) 和△4.氧杂.甾体.5伍.还原酶ff_xz 1.3.99.5)等几种不同的表示方法,但通常均

用甾体5洳还原酶来表示。甾体还原酶是依赖NAD PH,键合于膜上的一种蛋白
质,对人的两性分化和雄激素的生理发挥极其重要的作用网。 5a-还原酶具有4个特性【刀:(1)催化雄性激素睾酮转化为活性更强的双氢睾酮 (DHT)(2)编码这个酶基因发生突变,引起一种雄性假两性畸形病症,影响

男性内部尿道系统的发育和外生殖结构的完善。(3)基因表达受组织中雄激素的
调节,如:前列腺和肝脏。(4)甾体5a-还原酶在几种内分泌紊乱中发挥作用,如: 前列腺增生、多毛症、秃顶等。
1.2

50【还原酶同功酶的基因结构:从分子水*对人和鼠的甾体还原酶同工酶研

究发现【9】两种同工酶是由256.260个氨基酸组成,分子量约为2100-2700,且氨
基酸顺序有相似的疏水性,均含有40%疏水性氨基酸,仅有16%带电荷侧链,

符合膜键何要求。同种同功酶对应氨基酸顺序氨基酸一致性分别为40%和50%,
预示I型酶,Ⅱ型酶存在其它特性差异。人和鼠I型酶的同源性可达60%,II型 酶同源性可达77%,表明同功酶存在种的差异。通过对甾体还原酶缺陷病人基因

的研究发现【101,I型酶基因完全正常,Ⅱ型酶基因有多个突变位点(约有20个),
Ⅱ型酶基因表现出遗传的不稳定性,治疗这些遗传疾病可以通过纠正5伍.还原酶Ⅱ 型的基因或提供正常甾体5a-还原酶。 1.3同功酶的组织分布:据报道llll鼠的非雌性目标组织和卵巢中的主要同功酶

1型及其mRNA,特别是肝脏中只产生同功酶1型,且雌性鼠肝脏中的同工酶l 型活性比雄性高10-20倍,2型酶的mRNA主要分布于生殖组织,如睾丸、输精 管的器官。进一步研究发现【?21正常前列腺的间质细胞和基底上皮细胞,精囊的 间质细胞,附睾的上皮细胞产生2型5a-还原酶,而增生的前列腺和前列腺肿瘤
仅由间质细胞合成Ⅱ型5a-还原酶。 以往认为55还原酶2发生作用在BPH的发病机理中起主要作用,而5a-还原

酶I所产生作用很小l-3J。但是最*的研究表明,使用2型5a.还原酶抑制剂治疗

温州医学院硕士学位论文 后*中双氢睾酮(DHT)水*下降70%,前列腺组织中双氢睾酮(DHT)下 降85—90%【14.15l。剩余的DHT来源于1型50【.还原酶的作用。由前列腺外的组织 中l型5a-还原酶产生的双氢睾酮(DHT)可以经血循环进入前列腺组织,或由前 列腺组织内可能存在的1型5a-还原酶作用产生。这两种途径产生双氢睾酮(DHT) 均可影响前列腺的生长。最*的研究已证实,前列腺组织存在1型5a-还原酶 mRNA,蛋白质和酶活性‘16】。前列腺内的l型5a.还原酶也参与前列腺内DHT的 产生。所以,1型5a-还原酶可能在BPH的发病机制中起一定作用。 2.5a-还原酶相关性研究: 2.1.BPH的发生与雄激素密切相关,尤其与前列腺内高水*的双氢睾酮(DHT) 含量关系密切l?7l。几乎所有的睾酮(T)都需要在5a-还原酶作用下转变为双氢 睾酮(DHT),双氢睾酮(DHT)的生物活性及其对雄激素受体的亲和力大大高 于睾酮。也正是因为5a.还原酶在雄激素.信号轴中起到的关键酶的作用,抑制5a- 还原酶活性,就可降低双氢睾酮(DHT)水*。爱普列特可以非竞争性地抑制5a- 还原酶活性,从而抑制睾酮向双氢睾酮转化,使前列腺腺体内双氢睾酮水*下降, 在不影响血清中睾酮水*的同时达到使前列腺体积缩小的目的。从理论上讲不会 影响睾酮在身体其他部位的生理功能,在药理原理上优于非那雄胺。 2.2.有研究显示,严重的SRD5a2基因突变可导致SRD5a2合成*P*研究 已经发现SRD5a2基因有两处突变点【19220】,一处是外显子的89号密码子 (V89L),Allen等【埔l发现其突变与未突变基因型相比睾酮和游离睾酮水*显著 降低。 2。3.Berthaut等【191发现,来自前列腺增生的上皮和基质培养细胞中的SRD5a2 的活性显著高于正常的前列腺细胞,因而爱普列特不仅可以抑制上皮细胞,还 可以抑制基质细胞的增殖,这也许可以解释为什么爱普列特临床效果要较非那 雄胺好。因为上皮细胞和基质细胞在BPH的发生中都起到重要的作用,它们共 同的过度增殖导致前列腺的增大。但有研究认为SRD5a2只可使前列腺组织中 的双氢睾酮(DHT)水*下降85%.90%,剩余的双氢睾酮(DHT)则来源于 SRD5a1的作用,这可能成为治疗BPH效果不满意的原因之一印】。 2.4。爱普列特治疗BPH的II期和Ⅳ期临床研究表明爱普列特能明显地改善患者 的下尿路梗阻症状,提高生活质量。使前列腺体积明显缩小,增加最大尿流率 及*均尿流率,并且可减少患者的残余尿量。随机对照试验结果显示,爱普列 特较非那雄胺治疗BPH起效更快,而远期疗效方面两者相比无显性差异。 2.5.Ⅳ期临床研究发现:4个月后,患者血清PSA水*较对照组明显下降。因此 服用爱普列特可能会干扰对前列腺癌的诊断,在筛选前列腺癌患者中应考虑到 5a-还原酶抑制剂对PSA的影响。但是遗憾的是目前尚无PSA下降程度量化的

温州医学院硕士学位论文
研究结果及长期服药与PSA关系的研究。

2.6.有报道称服用爱普列特可抑制大鼠产生3,2.二甲基l-4.氨基联苯(DMAB)
,而后者可诱导某种促使大鼠患前列腺癌的抗雄激素基因的产生,因而我们期 望爱普列特存在抗前列腺癌的作用【2t】,但这方面需要大量的临床研究去进一步 证实。 2.7.应当看到,前列腺增生引起的排尿梗阻由两种因素构成:一是增生的前列

腺组织对前列腺部尿道的压迫所引起的静力因素;二是与交感神经兴奋程度有
关的动力因素。而II期和Ⅳ期临床研究所选择的BPH患者前列腺重量标准为
35

g以上,爱普列特可使前列腺体积缩小,从而解除机械性梗阻,改善排尿

症状和尿流率。但对主要由动力因素引起的下尿路症状,爱普列特可能仍有一
定的局限性。 2.8.爱普列特不良反应程度多较轻。发生恶心等胃肠道不适的不良反应可能与

药物主要经胃肠道排泄的特点有关。出现头晕、恶心的时间与其药代动力学中达 到稳态血药浓度的时间相符,且症状多自动消失。Auclet报道c22】爱普列特代谢
物主要存在于胆汁中,而原型药则主要从粪便中排出,考虑是由于胆汁中排出的 代谢物在肠道被还原成原型药物。出现失眠症状,考虑可能是药物在体内的代谢 转化影响到植物神经功能。

2.9.爱普列特可影响勃起功能并可导致性欲减退,其原因目前尚不明确。可能 与性器官中DHT水*下降有关,还有待进一步研究,应在用药前明确告知病
人∞】。 3.5a-还原酶抑制剂的研究概况 目前国内外用来治疗BPH的5a.还原酶抑制剂主要有三种,分别是非那雄胺,

爱普列特,度他雄胺。国内使用较为广泛的是非那雄胺和爱普列特,国外则以非 那雄胺和度他雄胺为主。三种药物虽然都是5a-还原酶抑制剂,但它们的作用机 制,作用位点却不尽相同。爱普列特是非竞争性抑制剂,它与5a-还原酶及还原
型辅酶Ⅱ(NADP+)形成稳定的复合物,从而阻止睾酮(T)向双氢睾酮(DHT)

转变,从而抑制双氢睾酮(DHT)的产生;保列治是睾酮(T)的类似物。能和 睾酮(T)竞争5Q.还原酶的结合位点,阻断睾酮(T)的转化,是竞争性抑制剂; 度他雄胺则是双重5tt-还原酶抑制剂,即同时抑制I型和II型5a-还原酶,使*
和前列腺组织中的双氢睾酮(DHT)下降。

MTOPS研究是一项前瞻性、随机、双盲、安慰剂对照的多中心的大规模长 期研究,由美国国立卫生研究所发起,因其设*衔晟疲鄄焓奔涑ざ艿焦
泛关注,并且可能对BPH药物治疗产生深远的影响。MOTPS研究共有3047名

BPH患者参加,分为安慰剂、多沙唑嗪、非那雄胺、多沙唑嗪和非那雄胺联合治

温州医学院硕士学位论文 疗四组,*均随访时间4.5年。研究对年龄、种族、症状指数、最大尿流率、前 列腺体积、PSA、移行带体积、并发症、手术干预机会、残余尿、性功能、生活 质量 等各方面进行评价。研究将症状指数增加4分、急性尿潴留、肾功能不全、反 复发作的泌尿系感染和尿失禁定为BPH的临床进展。在疗效方面,通过将*5 年的观察,非那雄胺组和多沙唑嗪和非那雄胺联合治疗组的症状指数增加4分 的风险分别*参考磷橄陆担常埃ァⅲ叮矗ァ6杂诩毙阅蜾罅舴缦赵蚍直鹣陆盗 68%和81%。手术干预机会分别下降了64%、67%,而多沙唑嗪组则没有明显减 少手术干预和急性尿潴留的风险,说明主要是非那雄胺的作用,多沙唑嗪并无此 作用。在PSA方面,安慰剂组和多沙唑嗪组分别上升了15%、13%,,非那雄胺 和联合治疗组均下降50%。前列腺体积方面,安慰剂组和多沙唑嗪组*均增加了 24%,非那雄胺和联合治疗组则下降了19%。另外,MTOPS研究也显示,血中 PSA能够预测疾病的进展情况,PSA水*越高,前列腺生长越迅速124],体积 增大越明显。基线PSA水*与急性尿潴留及手术干预的风险呈正相关。5 Q还原 酶抑制剂治疗能够有效降低PSA水*,延缓疾病的进展。MTOPS研究是迄今 为止最大规模的关于BPH药物治疗方面的研究,对于BPH的自然病程、药物治 疗的有效性和安全性、病程进展的危险因素等方面都取得了重大进展。从MTOPS 研究结果可以看出,非那雄胺可以有效的改善BPH症状,缩小前列腺体积,降 低血中PSA水*,减少急性尿潴留风险及手术干预的机会,并且经过长期的临 床观察,未发现严重不良反应,证明是安全的5a-还原酶抑制剂。总之,非那雄 胺是安全有效的治疗BPH药物。度他雄胺能同时抑制1型和2型50【.还原酶, 即双重50r-还原酶抑制剂,降低前列腺组织中双氢睾酮(DHT)水*,抑制前 列腺的增生。根据前文的研究结果,有学者就提出,如果能将l型和2型5a-还 原酶都抑制有可能将前列腺组织中的双氢睾酮(DHT)下降更多,与仅抑制2 型5a-还原酶相比有更好的的临床效果‘25】。但是这一观点一直存在这争议。 而爱普列特作为一种非竞争性2型5a-还原酶抑制剂,它与5a-还原酶及NADP +形成稳定的三元复合物,此过程不可逆,从而阻断睾酮(T) 向双氢睾酮

(DHT)转变,抑制前列腺的增生。爱普列特可选择性和专一性地抑制2型50r- 还原酶,对1型5a-还原酶作用微弱。有研究发现‘25】,服用爱普列特后前列腺组 织中T 13 RII

rIl】埘A和蛋白表达水*较对照组明显上调,免疫组化结果表明未经

爱普列特处理的前列腺上皮细胞T 13 RII表达为弱阳性,经爱普列特处理的前列 腺上皮细胞T 13 glI表达明显增强,而T 13
R II被认为与前列腺细胞凋亡有关。Sun

[263等研究也证实,爱普列特是通过抑制前列腺细胞增生,促进前列腺细胞凋亡;

温州医学院硕士学位论文

来缩小前列腺体积的。其可能的途径有二:一方面,使进入细胞核的促进增殖的
信号减低,从而抑制细胞内特异性生长因子及其受体的表达来抑制前列腺细胞的 增生。另外,增强前列腺细胞促进凋亡的生长因子及其受体的表达来加速细胞的 凋亡。国内的II期临床研究‘273采用多中心随机对照试验和开放试验观察爱普列

特治疗BPH的疗效和安全性。共467例病人参与本试验,分为爱普列特,保列
治和开放试验3组,试验对前列腺症状评分(口SS),最大尿流率(Qmax),*

均为显效,有效,改善,无效四个疗效判断标准。首先,在临床疗效方面,实验 组的各个疗效指标在给药2个月和4个月后较给药前均有显著的改善,综合疗效 的2个月有效率为76.6%,4个月有效率为91.6%。前列腺症状评分,最大尿流
率和*均尿流率在率为58.9%,4个月有效率80.4%;开放组分别为54.8%和

80.7%。在安全性评价方面,分别为实验组8例,对照组16例,开放组34例,
各种不良反应均为轻中度反应,患者多可耐受,各组中均只有1例因不良反应停 药,停药后恢复正常。爱普列特Ⅳ期临床研究【2s】是由北京大学泌尿外科研究所 发起,全国5个中心共48家三甲医院共同参与的多中心开放临床试验,共2085例

BPH病人参与本试验,1984例完成整个观察。*均观察时间4个月。主要观察
指标有前列腺症状评分(IPSS)和生活质量评分(QOL)、最大尿流率(Qmax) 和*均尿流率(Qave)、前列腺体积(V)、残余尿量(RU)。安全性观察项目包 括不良事件,性功能状态和实验室检查。性功能方面包括国际勃起功能评分 (皿亚.5),性欲及射精功能。各项观察指标改善情况见下表1:

农I



98,1例BPH患者爱普列特治疗前后
备项疗效指标的比较(f士s)

注:各项指标给药前后比较.P值均<O.0001

温州医学院硕士学位论文 综合疗效判断,1984例患者治疗4个月后显效692例(34.9%),有效962例 (48.5%),改善265例(13.6%),无效65例(3.3%),总有效率83.4%。安全性
评价无严重不良反应事件发生,与药物有关的或可能有关的不良事件133例

(6.63%),多为轻中度反应,主要为胃肠道反应,性功能减退,头晕和皮疹,仅
20例因不良反应而退出观察。性功能方面,治疗后IIEF.5从给药前9.25±7.29 下降至8.14±7.19,性欲降低及射精量减少例数明显增加,提示爱普列特对性功 能有一定影响。实验室检查异常发现率2.49%,主要为转氨酶、胆红素、尿素氮、

肌酐升高。爱普列特II期和Ⅳ期临床研究结果表明,爱普列特是一种安全有效的 治疗BPH的药物,可显著改善患者的排尿症状,提高生活质量,缩小前列腺体
积,增加尿流率,减少残余尿。而且在改善症状,缩小前列腺体积,改善最大尿

流率方面要优于保列治。随机对照试验结果显示,爱普列特较非那雄胺起效更迅 速129]。爱普列特对患者血清PSA和性功能有一定影响,原因目前尚不明确,可 能与DHT下降有关刚。从目前观察结果来看,该药无严重不良反应,与该药有
关的不良反应发生率较低131l。 随着人们对BPH病因机发病机制认识的不断深入,药物治疗BPH得到了 广泛的发展。5a-还原酶抑制剂做为BPH治疗的一线用药,已得到了广大医务人

员和患者的认可,相关的研究也取的重大进展,这必将对BPH的药物治疗产生
长远的影响。 参考文献
【1】Emberton M,Andriole
GL,Rosette J,et at Benign prostatic

h卿lasia:a

progressive disease

ofaging moll.Urobgy,2003,61:267-273.

【2】Wilson

JD,Steers

WD,Geroge



w,et

at The pathogenesis of

b锄i弘prostatic hyperplasia.Am.

J,Med,1980,68:745. 【3]tevy,HR,Talalay,EBaeterial oxidation ofsteroids.II.BioL Chem,234:2014-2021. 【4】Shlma2aki J,IQu'ihara H
Ito Y,Ot a1.Metabolism of testosterone h prostate.2.Separation of

prostatic 17beta-oldehydrogenase and 5alpha-reductase.Gunma.J.Med.Sci,1965 Dec;14:326-333.

【5】Shefer S,I-huser S,Mosbach

EH,et at Studieson the biosynthesis of 5-alpha-eho lestan232beta-

ot I.Cholestenone 5-alpha-reduetase of rat liver.BiolChem,1966 Feb 25;241.946-952.

【6】Nakayama O,YagM,Tanaka M’et at novel
from


testosterone 5alpha-reductase inhibitors isolated

Streptmayees.I.Taxonomy,fermentation,isohtion,physieoehemieal characteristics.Anti
Aug;42:1221-1229.

.blot.(Tokyo),1989

温州医学院硕士学位论文
【7】Andersson
S,Russell DW,Jenkins EP,et at Structural and biochemical properties of cbned锄d

expressed human and rat steroid 5alpha-reductases.Proe.Natl.Acad.SeiUSA,1990 May;97"3640. 3644

【8】S Andersson,RW B/shop,DW

Russell,et aL Expression ebnmg and regulation of sterojd 5 sexual

却ha-reduetase,all
264:16249.16255.

enzyme

essential for male

differentiation.BiolChem,Sep 1989,

【9】Russell

Dw,Wdson

JD,Jenkins EP,et at

Steroid 5A22reduetase:two

genes.two enzyms.

Ann.Rev.Biochem,1994,63:25.

【10】Andersson S,Berman DM,Russell DW,et
male

aLDelet如of steroid 5却ha—reductase

2 gene in

psendohcrm

aphroditism.Nature,1991 Nov 14;354:159-161. Tissue distribution and kinetic characteristics of for

【11]K Normmgton,DW Russell,S Andersson,et at
rat

steroid



alpha-reduetase

isozymes:Evidence

distinct physiobgieal

functions.BioL

Chem.Sep 1992;267:19548-19554.

【12】张元芳,叶烈夫,丁强等.前列腺组织2型5a-还原酶表达的研究.中华泌尿外科杂志.
2001,7.11

【13】SteersWD.Wdson
2001,58:1 7—24.

JD,Geroge FW,et a1.5-alphareduetase activity in the prostate.Urobgy.

【14】McConell JD,Wdson JD,Geroge
surppresses prostatic



W,et at

Finasteride,a inhibitor

of5?由ha reduetase,

dihydrotestosterone

in moll with benign prostatic hyperplasia.Oin

Endrocrmol Mctab,1992,74205?508.

【15】Norman RW,Coakes.KE,Wright

AS,et at Metabolism in men receving fmasteride before

prostatectomy.Uroi,1993,1 50:1 736-1 739.

【16】sartsch G'Rittmaster ItS,Kloeker,et a1.DLmydrotestosterone and the

concept of

5却ha

reduetase inhibition in human benin‘prostatic hyperplasia.World J Urol,2002,19:413.425.

【17]Rochrbom CG'MeConell JD,Jacobs S,ot at Baseline
predict
rate

progam volume and

serum PSA

ofprostate growth:analysis ofthe MOPS

data.Urol,2003,169(supple).364.

【1 8】Lee

C,Kozlows ki J M,Grayhae k J T,et at Etiobgy of benign prostatio hyperphsia.Urol

aill Nort hAm,1995,22:237-246.

【19]Allen NE,Forrest MS,gey TJ,et at

The association betweell polymorphisms in the CYPl7 and

5由ha-reduetase(SRD5A2)genes
biomaker Prey,2001,10:185-189.

and Serl皿androgen concentrations in men.Cancer Epidemiol

【20】Berthaut I,Mestayer C,Portois MC,et at Pharmacobgieal
expressbn of the

and molocular evidence for the

two

steroid



alpha-reductase isozymes缸normal and hypo印lastic human

prostatic ceils in oJlture.Prostate,1997,32:155-163.

.54.

温州医学院硕士学位论文
【2 l】Andriok,GL,Kirby R,McCondl
JD,et at Safety and

tol鼬i lity

of the dual 5 alpha-reductase

inh ibitor dutasteride in the treatment of

benign

prostatic hyperplasia.Fan"Urol,2003,44:82-88. effects of Anti-androgenic

【22】Akaza H,TsukamotoS,Morita T.Promoting
prostate

agents

on

rat

ventral

carcinogenesis

induced by

3,2-dnnethyb4一aminobiphenyl(DMAB).Prostate Cancer

Prostatic Dis,2000,3:1 15—119.

【23】Aucbt

PH,Lamb

Yjorkasky D,etal.Effect
sortllll

of multipicdoscs

of

epristends,a

steroid 5一

reductase inhibitor,on 1993,53 231-233.

dihydrotestosterone缸older male subjects.C1in Pharmacol Thor,

【24】李宁忱,那彦群,丁强等.爱普列特治疗良性前列腺增生Ⅳ期临床研究.中华泌尿外科 杂志,2002,7:413-416. 【25】Wu Shu-Fang,Sun TGF-IB
Hong—Zhi,Tu Zeng-I-bng,et at Effect of epristeride
on

expression of

receptor in rat prostatic epithelial cells in vitro.Aeta Pharmaeol Sin,2001,22:516-520. XD,et at F_fleet of epristeride
on

【26】Sun 82;Wu SF,Qi
receptors irI

the expression of IGF—l and TGF-IB

androgen-induced

castrated rat prostate.Exp Biol

Med(maywood),2001,226.9-960.

【27]薛兆英,韩文科,金杰等.爱普列特治疗良性前列腺增生Ⅱ期临床研究.中国临床药理 杂志.2000,16:432-435. 【28】李宁枕,那彦群,丁强等.新型5弘还原酶抑制剂爱普列特治疗良性前列腺增生的Ⅳ期 临床研究.中华泌尿外科学杂志.2002,23.413416. 【29】Sun ZY,WU FlY,Wang MY,et
a1.The mechanism of

epristeride

against蛐prostatic

hypcrplasia.Fur J Pharmacol,1999,371 227-233.

【30】Rusell

D W’Wilson JD,S

Andcrsson,ct at

Steroid 5-alpha reductase:twogenes/two ellzymo¥.

Annu Rev Bioehem,1994,63:25—61.

【3 1】Auclet

PH,Lamb Y,Jorkasky D,et at Effect of multiplo doses epristeride:a steroid 5-alpha
SOl'U1]l

reductase inh击itor,on 1993,53231-233.

dihydrotestosterone in

older male subject.Clin pharmacoi Ther,

.55—

爱普列特治疗老龄大鼠前列腺增生症作用机制的初步研究
作者: 学位授予单位: 吴伟 温州医学院

相似文献(10条) 1.期刊论文 陈卫国.陈昭颉.王庆堂.杨航 爱普列特治疗前列腺增生的疗效观察 -华西药学杂志2002,17(2)
用爱普列特治疗前列腺增生,治疗后前列腺症状评分、生活质量评分、前列腺体积、膀胱残余尿及最大尿流率、*均尿流率均有明显的改善 (P<0.05).

2.期刊论文 吴建辉.朱焰.孙祖越 治疗前列腺增生的国家一类新药——爱普列特 -药学进展2002,26(1)
治疗良性前列腺增生症(BPH)的新药爱普列特能非竞争地抑制睾酮向双氢睾酮(DHT)转化,缩小前列腺体积,抑制其增生.本文简要介绍*年来有关 BPH病理方面的研究结果和新药爱普列特的作用机制及其对生殖系统的影响.

3.期刊论文 吴伟.蔡冰.许刚.陈伟.李澄棣.陶志华 爱普列特对老年大鼠前列腺增生组织中微血管的影响 -浙江医 学2009,31(3)
目的 探讨新型5α-还原酶抑制剂爱普列特对老龄雄性SD大鼠前列腺增生组织的微血管的影响及作用机制.方法 将70只已增生老龄雄性SD大鼠随机分 为爱普列特大剂量组(20只)、小剂量组(20只)、非那雄胺组(20只)及对照组(10只),并分别采用免疫组化SP法和SABC法检测、对比各组大鼠前列腺增生组 织中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和CD34的表达情况.结果 爱普列特大剂量组、小剂量组及非那雄胺组MVD值(4.35±2.20、6.25±1.29、4.90±1.29)及 eNOS(72.27±48.50、163.89±91.40、144.82±80.78)均明显低于对照组(8.00±2.98、293.58±116.0)(均P<0.05);而且爱普列特大剂量组MVD值明显低 于小剂量组(P<0.05),eNOS明显低于小剂量组及非那雄胺组(P<0.05).结论 爱普列特对大鼠前列腺增生组织中血管的生成具有明显的抑制作用,其可能是 通过下调eNOS及CD34的表达来实现的.

4.期刊论文 薛兆英.韩文科.金杰.张元芳.丁强.王晓雄.曹立军 爱普列特治疗良性前列腺增生Ⅱ期临床研究 -中国 临床药理学杂志2000,16(6)
目的:采用多中心随机对照试验和开放试验观察爱普列特治疗前列腺增生的疗效和安全性。方法:对照药为保列治,467例病人试验组114例,对照 组119例,开放组234例,试验组服用爱普列特5mg,每日三次,对照组服用保列治5mg,每日一次,疗程4个月。结果:试验组总有效率为91.6%,对照组 为80.4%,开放组为80.7%,药物不良反应均为轻中度,分别为3.7%, 7.1%和7.8%。结论:爱普列特是治疗前列腺增生的一种安全有效的药物,其疗效和 耐受性与对照药保列治类似。

5.期刊论文 韩宇.许勇.符伟军.洪宝发.HAN Yu.XU Yong.FU Wei-jun.HONG Bao-fa 爱普列特联合热淋清治疗老年 前列腺炎疗效观察 -中国医院用药评价与分析2008,8(5)
目的:评价爱普列特联合热淋清治疗老年慢性前列腺炎的有效性和安全性.方法:52例受试者以1:1随机进入联合药物治疗组和对照治疗组.在完成2周 的筛选期后,联合药物治疗组接受爱普列特5 mg,bid,热淋清4 g,对照治疗组仅接受爱普列特5 mg,bid,共2个月,治疗前后分别询问症状和不良事件,测量 前列腺体积(TRUS),进行美国泌尿协会症状指数评分(AUA-SI),检测前列腺特异抗原(PSA),作2次前列腺液(EPS)常规检查,对比评价爱普列特联合热淋清治 疗老年前列腺增生合并慢性前列腺炎的有效性和安全性.结果:服药前后联合药物治疗组和对照治疗组在临床症状、前列腺体积、AUA-SI、EPS的变化差异 均有显著性(P<0.05).药物治疗过程中未发现不良事件.结论:爱普列特联合热淋清治疗老年慢性前列腺炎是有效的,建议临床推广应用.

6.期刊论文 赵永久.郑新民.李世文.胡礼泉.马胜利.代利华 爱普列特对良性前列腺增生的安全性观察 -医药导报 2001,20(11)
目的:观察爱普列特治疗良性前列腺增生(BPH)的安全性.方法:入选46例患者口服爱普列*5 mg,bid,疗程4个月.结果:受试者中7例停药,39例完成 试验,7例(10例次)出现副作用(4例失眠,3例恶心,2例头昏,1例性欲减退)而停药.服药2,4个月后,部分*生化指标较服药前差异有显著性,这些指标变化 幅度较小且均在正常范围内,不具有临床意义.结论:爱普列特是一种较为安全的治疗良性前列腺增生药物.

7.期刊论文 李启忠.王向阳.赵战强.LI Qizhong.WANG Xiangyang.ZHAO Zhanqiang 爱普列特治疗良性前列腺增生 症尿流指标的研究分析 -实用诊断与治疗杂志2006,20(12)
目的:研究服用爱普列特治疗良性前列腺增生症的尿流指标的改变.方法:门诊收集单独服用爱普列特并超过3个月以上的前列腺增生症患者60例,回顾 性分析该组患者服用爱普列特前后前列腺体积、症状评分、残余尿量、尿流率的变化.结果:服用爱普列特3个月后,前列腺体积缩小,最大尿流率增加,国 际前列腺症状评分下降,残余尿量下降,本组患者无尿潴留发生.结论:爱普列特客观上能够改善前列腺增生症患者的排尿梗阻症状,是保守治疗良性前列腺 增生症的有效药物.

8.学位论文 钟恩宏 爱普列特对前列腺癌细胞的体外抑制作用及前列腺癌前病变机制探讨 2003
睾丸酮(testosterone T)在前列腺中被5α-还原酶还原为双氢睾丸酮(dihydrotesterone DHT),后者在前列腺癌的发生发展中起着重要作用.爱普列 特(epristeride),一种新的甾体5α-还原酶抑制剂已在中国成功地用于临床治疗前列腺增生.该研究旨在探讨爱普列特对LNCaP和PC3前列腺癌细胞的抑制 作用及其可能机理.另外,T在前列腺增生与前列腺癌中均起着重要作用,以及血清PSA在前列腺增生与前列腺癌中均有较大程度的升高,鉴于前列腺增生与 前列腺癌有着众多共同的病因,我们采用体内外实验在分子水*上探讨前列腺增生是否为前列腺癌的癌前病变.在前列腺癌前病变实验中,我们将PSA基因 转入增生的前列腺上皮细胞中并加入丙酸睾丸酮(testosterone propionate TP)共同培养3星期后未发现细胞癌变;在整体动物实验中,我们给去势后的低 、中、高实验组beagle犬分别给予TP,剂量分别为7.5、15.0和22.5mg/kg,10个月后,发现前列腺和输精管腺腔变大及输精管管壁增厚变粗,前列腺病理切 片未发现有癌变细胞.表明前列腺增生可能不是前列腺癌的癌前病变.

9.期刊论文 李宁忱.那彦群.丁强.张元芳.吴宏飞.杨宇如.鲁功成.郭应禄 新型5α-还原酶抑制剂爱普列特治疗良 性前列腺增生的Ⅳ期临床研究 -中华泌尿外科杂志2002,23(7)
目的探讨新型非竞争性5α-还原酶抑制剂爱普列特(epristeride)治疗良性前列腺增生(BPH)的有效性及安全性. 方法采用多中心开放临床试验方法 ,对2 006例BPH患者进行为期4个月的观察.口服爱普列特每日2次,每次5 mg. 结果给药后4个月,国际前列腺症状(IPSS)评分较治疗前*均降低 6.12分 (28.8%),P<0.0001;最大尿流率较治疗前*均增加3.48 ml/s(33.4%),P<0.0001,前列腺体积*均缩小4.91 ml(11.6%),P<0.0001;剩余尿量*均减少19.1 ml(38.4%),P<0.0001,差别均有极显著性意义.治疗总有效率83.4%.临床不良反应发生率6.63%,多为轻中度.实验室检查异常发生率2.49%. 结论爱普列特 可明显改善BPH患者的排尿症状、缩小前列腺体积、增加尿流率、减少剩余尿量,不良反应发生率低,是一种安全有效的治疗BPH的新药.

10.期刊论文 赵永久.郑新民.李世文.胡礼泉.马胜利.代利华 爱普列特对良性前列腺增生的疗效观察 -医药导报 2001,20(12)

目的:观察爱普列特治疗良性前列腺增生(BP H)的临床效果.方法:入选BPH患者共41例口服爱普列*,5 mg, bid,共4个月.结果:服药前后国际前列 腺症状评分(Ⅰ-PSS)、残余尿量(RU)、最大尿流率(Qmax)、前列腺体积(PV)的变化差异均有显著性(P<0.05或0. 01),4个月时有效率为92.68%.结论:爱 普列特是一种有效的BPH药物,值得临床推广应用.

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